Angela Wieland

• Replication stress has been extensively studied in the context of DNA synthesis defects and downstream consequences such as genomic instability and tumorigenesis. However, the specific mechanisms linking replication stress to mitotic errors, particularly the formation of persistent sister chromatid connections such as ultrafine anaphase bridges, remain insufficiently defined. Many proteins and regulatory pathways have been identified to manage these chromosome junctions throughout the cell cycle, either by preventing their formation or facilitating their resolution. While proteins such as BLM, PICH, and FANCD2 have been identified as ultrafine anaphase bridge-associated factors, their precise role in genome maintenance is not yet fully understood. Considering the detrimental impact of mitotic errors on cell fate and their potential role in cancer development, it is essential to investigate further the roles of ultrafine anaphase bridge-associated proteins, their molecular interactions, and the mechanisms through which they preserve genomic integrity. Using CRISPR/Cas9 technology, the generation of cell lines with controllable auxin-induced protein degradation provides a powerful tool for dissecting the functions of anaphase bridge-binding proteins, enabling precise investigation of their roles at specific cell cycle stages. Additionally, fluorescent tagging of target proteins facilitates protein detection and allows for real-time visualization. This work provides a fundamental basis for the establishment of such degradation system-based cell lines via a modular cloning strategy as well as the successful generation of a cell line for the anaphase bridge-binding protein BLM for rapid and targeted research in specific contexts. Loss of functional BLM led to increased sister chromatid exchange, reduced proliferative capacity, and, especially under replication stress, a pronounced decline in colony-forming ability accompanied by elevated DNA damage, mitotic aberrations, and micronuclei formation. These observations highlight the critical role of BLM in preserving genomic integrity and sustaining cell viability, particularly under conditions that challenge the stability of the genome. Additionally, it was observed, for the first time to our knowledge, that BLM’s association with ultrafine anaphase bridges during mitosis represents a function that is independent of its roles in other phases of the cell cycle. Using the AID system, this finding suggests that BLM operates through stage-specific mechanisms that are not necessarily interconnected. In particular, the exclusive role of BLM during mitosis is shown to be critical for attenuating the development of mitotic aberrations and anaphase bridges, thereby preventing deleterious consequences such as genomic instability.
• Replikationsstress ist im Zusammenhang mit DNA-Synthesedefekten und den sich daraus ergebenden Folgen wie genomische Instabilität und Tumorentstehung eingehend untersucht worden. Die spezifischen Mechanismen, die Replikationsstress mit mitotischen Fehlern verbinden, insbesondere die Bildung persistenter Schwesterchromatidenverbindungen wie ultrafeine Anaphase-Brücken, sind jedoch noch unzureichend definiert. Es wurden zahlreiche Proteine und Regulationswege identifiziert, die diese Chromosomenverbindungen während des Zellzyklus steuern, indem sie entweder ihre Bildung verhindern oder ihre Auflösung erleichtern. Während Proteine wie BLM, PICH und FANCD2 als ultrafeine Anaphase-Brücken-assoziierte Faktoren identifiziert wurden, ist ihre genaue Rolle bei der Erhaltung des Genoms noch nicht vollständig geklärt. In Anbetracht der schädlichen Auswirkungen mitotischer Fehler auf das Zellschicksal und ihrer potenziellen Rolle bei der Krebsentstehung ist es von entscheidender Bedeutung, die Rolle der ultrafeinen Anaphase-Brücken-assoziierten Proteine, ihre molekularen Interaktionen und die Mechanismen, durch die sie die genomische Integrität bewahren, weiter zu untersuchen. Mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie können Zelllinien mit kontrollierbarem Auxin-induziertem Proteinabbau generiert werden, was ein wirkungsvolles Mittel zur Untersuchung der Funktionen von Anaphase-Brückenbindungsproteinen darstellt und eine präzise Untersuchung ihrer Rolle in bestimmten Zellzyklusphasen ermöglicht. Darüber hinaus erleichtert die Fluoreszenzmarkierung der Zielproteine den Nachweis der Proteine und ermöglicht eine Visualisierung in Echtzeit. Diese Arbeit liefert eine grundlegende Basis für die Etablierung solcher auf dem Auxin-induziertem Proteinabbau basierender Zelllinien durch eine modulare Klonierungsstrategie. Zudem wurde für die schnelle und gezielte Forschung in spezifischen Kontexten erfolgreich eine Zelllinie für das Anaphase-Brückenbindungsprotein BLM generiert. Der Verlust des funktionellen BLM führte zu einem erhöhten Austausch von Schwesterchromatiden, einer verringerten Proliferationsfähigkeit und, insbesondere unter Replikationsstress, zu einem deutlichen Rückgang der Fähigkeit zur Koloniebildung, begleitet von erhöhten DNA-Schäden, mitotischen Aberrationen und der Bildung von Mikronuklei. Diese Beobachtungen unterstreichen die entscheidende Rolle von BLM bei der Erhaltung der genomischen Integrität und der Lebensfähigkeit der Zellen, insbesondere unter Bedingungen, die die Stabilität des Genoms in Frage stellen. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal unseres Wissens nach festgestellt, dass die Assoziation von BLM mit ultrafeinen Anaphase-Brücken während der Mitose eine Funktion darstellt, die unabhängig von seiner Rolle in anderen Phasen des Zellzyklus ist. Unter Verwendung des AID-Systems deutet diese Erkenntnis darauf hin, dass BLM durch zellzyklusspezifische Mechanismen wirkt, die nicht unbedingt miteinander verbunden sind. Insbesondere die ausschließliche Rolle von BLM während der Mitose erweist sich als wesentlich für die Abschwächung der Entwicklung von mitotischen Aberrationen und Anaphase-Brücken, wodurch schädliche Folgen wie genomische Instabilität verhindert werden.