Benjamin Selmke

• Ziel im ersten Teil dieser Arbeit ist die Untersuchung der offenen und geschlossenen Konformation des Maltose bindende Proteins (MBP) im nativen und Molten-Globule-(MG)-Zustand mit Hilfe der ESR-Spektroskopie. Die komplexen Mechanismen der Proteinfaltung und Proteindynamik bilden schon seit Langem ein wichtiges Forschungsziel in der Untersuchung biochemischer Prozesse und der Enzymkinetik. MBP bietet sich in diesem Zusammenhang als geeignetes Forschungsobjekt an, da die Konformationsunterschiede des MBP gut erkennbar sind und sich der MG-Zustand genügend lang für Untersuchungen stabilisieren lässt. Die Fähigkeit zur reversiblen Faltung ist für ein Protein dieser Größe ebenso wie die Ausbildung eines hoch geordneten MG-Zustands mit hoher Affinität zu seinem Zielsubstrat ungewöhnlich. Der besondere Vorteil der ESR-Spektroskopie ist die geringe Störung der Messung durch das Messsystem, was die Möglichkeit liefert, das Protein unter nativen Bedingungen, selbst innerhalb von Membranen oder biologischen Systemen, zu untersuchen. Die in dieser Arbeit verwendete site-directed spin-labeling (SDSL)-Methode, bei der eine kovalente Bindung von Nitroxid-Spinlabel (NSL) an das Protein eingesetzt wird, löst kaum Störungen im System aus und schränkt die Flexibilität der Proteine kaum ein. Als Grundlage der ESR-spektroskopischen Untersuchungen dienen im Haus durchgeführte cw-ESR-Messungen und DQC-Messungen, welche bei unserem Kooperationspartner Prof. J. Freed im ACERT Institut, Ithaca, New York, durchgeführt wurden. Die double quantum coherence (DQC)-ESR beschreibt eine spezifische Messmethode zur Analyse der dipolaren Elektron-Elektron-Wechselwirkungen durch Isolierung des Elektron- Spin-Echos und somit der Abstandsbestimmung zweier NSL unter Verwendung einer spezifischen Pulsabfolge. Der größte Vorteil dieser Methode ist die Minimierung störender Hintergrundsignale, ein geringes Signal-Rausch-Verhältnis und die mögliche Bestimmung von Abständen zwischen 10 und 80 °A. Über Molekulare-Dynamik-(MD)-Simulation lässt sich ein guter Einblick in die Struktur von Proteinen gewinnen und ein Model der gelabelten Proteine entwickeln. Die These, dass MBP bereits ohne seinen Liganden beide Konformationen einnimmt, kann durch die DQC-Messungen und die Korrelation mit der MD-Simulation bestätigt werden. Weiterhin kann nachgewiesen werden dass eine Grundstruktur von MBP und ein funktionell ausgebildetes aktives Zentrum bereits im MG-Zustand vorliegt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Möglichkeit untersucht freie Radikale in verschiedenen Systemen, auch innerhalb von Zellen, mittels ESR-Spektroskopie zu detektieren und zu analysieren. Die Zielsetzung dabei ist es, die Radikalbildung bei verschiedenen medizinischen Behandlungen zu untersuchen. Die Lebensdauer einer Zelle wird durch das Zusammenspiel von freien Radikalen mit Antioxidantien, Proteinen, Cofaktoren und sonstigen Zellbestandteilen bestimmt. Durch bessere Kenntnis dieses Zusammenspiels können große Fortschritte in Medizin und Gesundheitsvorsorge erreicht werden. Sollte die Bildung der Sauerstoffradikale das natürliche antioxidative Potential der Zelle überschreiten, spricht man von dem “oxidativem Stress” der Zelle. Zu den möglichen Folgen des oxidativen Stresses gehört die Schädigung aller zellulären und extrazellulären Makromoleküle bis hin zur Apoptose, also dem Absterben der Zelle. Die primären Folgen sind vor allem die Lipidperoxidation, die Proteinoxidation und die Schädigung der DNA. Durch die Verwendung von ESR-spektroskopischen Methoden ist es möglich Untersuchungen innerhalb lebender Zellen durchzuführen. Zur Detektion der Radikale wird dabei ein Radikalfänger (Spin trap) eingesetzt, welcher a priori kein ESR-Signal liefert, sondern erst durch den Kontakt mit dem freien Radikal ein ungepaartes Elektron und somit ein ESR-Signal aufweist. Die Verbindung 2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrol-1-oxid (EMPO) ist ein Derivat des DMPO, in welchem die Nitroxidgruppe zusätzlich stabilisiert wird. Hierdurch kommt es zu einer deutlich längeren Lebensdauer der Spin-Addukte und einer besseren Auflösung der ESR-Messung. Die entstehenden Signale der einzelnen EMPO-Addukte lassen sich mit geeigneten Methoden simulieren. Dies ermöglicht die Analyse der entstandenen Radikale. Während unter der Strahlenbelastung von CT- und MRT-Untersuchungen keine Radikalbildung in den Proben festgestellt werden kann, liefert die Strahlentherapie mittels Linearbeschleuniger ein breites Spektrum gebildeter Radikale. Die Ausbildung dieser Radikale zeigt sich dabei von verschiedenen Faktoren abhängig. So zeigt sich die Ausbildung von H-, OH- und OOH-Addukten durch Luftsauerstoff begünstigt, die Zugabe von NaCl fördert die Ausbildung von Wasserstoffradikalen und organische Pufferbestandteile, wie z.B. Tris oder HEPES, führen zur erhöhten C-Addukt- Bildung.