Helen Wegner

• Bacteriophages are key players in microbial ecosystems, often harboring auxiliary metabolic genes (AMGs) that influence host metabolism during infection. These AMGs are widely distributed in phage genomes and metagenomic sequences originating from phages, but their exact role remains enigmatic. This study explored AMGs from metagenomic datasets of diverse origins related to tetrapyrrole metabolism, a critical pathway for heme and pigment biosynthesis. Within this study, bioinformatic analysis of viral metagenomic data identified a three-gene cassette consisting of ho1, pcyA/X, and alaS genes. While viral ho1 and pcyX have been found before in marine datasets and encode a heme oxygenase and a ferredoxin-dependent bilin reductase for linear tetrapyrrole biosynthesis, the identification of alaS is intriguing. alaS encodes a putative aminolevulinic acid synthase (ALAS), an enzyme that catalyzes the first committed step in tetrapyrrole biosynthesis in alphaproteobacteria to produce aminolevulinic acid (ALA). This so-called C4 pathway is in contrast to the C5 pathway of ALA formation, which is present in all other bacteria and archaea. This is the first report of a phage-encoded alaS in a cassette with linear tetrapyrrole synthesis-associated AMGs (ho1, pcyA/X), suggesting a potential role in increasing the metabolic flux through the tetrapyrrole pathway. The cassette was detected in various metagenomic datasets derived from marine and freshwater habitats, but in freshwater, alaS was not associated directly with this cassette and could be found further up-/downstream on the contig. Using a combination of in silico structure prediction and amino acid sequence alignment, the viral alaS gene seems to be a functional C4 pathway enzyme that uses glycine and succinyl-CoA for ALA synthesis. This was proven by functional complementation using plasmid-encoded viral ALAS (vALAS) that successfully recovered the growth of an ALA-auxotrophic E. coli C5 pathway mutant. Furthermore, the specific enzymatic formation of ALA by vALAS in complemented cell lysate was verified marking the first time a viral ALAS is enzymatically active. Further, the remaining freshwater-derived AMGs were analyzed for their activity. The vHo1 showcases heme conversion to biliverdin IXα, verifying its role as an active heme oxygenase. Surprisingly, vPcyA produces phycocyanobilin (PCB), the chromophore that forms a functional phytochrome, thus verifying it as an active PcyA enzyme. This study elucidates the distribution and roles of these AMGs across various ecological niches, enhancing the understanding of phage-driven metabolic processes.
• Bakteriophagen sind wichtige Bestandteile mikrobieller Ökosysteme. Sie enthalten oft zusätzliche Stoffwechselgene (AMGs), die den Stoffwechsel des Wirts während der Infektion beeinflussen. Diese AMGs sind in Phagengenomen und metagenomischen Sequenzen, die von Phagen stammen, weit verbreitet, aber ihre genaue Rolle bleibt ungeklärt. In dieser Studie wurden AMGs aus metagenomischen Datensätzen unterschiedlicher Herkunft untersucht, die mit dem Tetrapyrrol-Stoffwechsel zusammenhängen, einem bedeutenden Stoffwechselweg für die Häm- und Pigmentbiosynthese. Im Rahmen dieser Studie identifizierte die bioinformatische Analyse viraler Metagenomdaten eine Drei-Gen-Kassette, bestehend aus ho1-, pcyA/X- und alaS-Genen. Während die viralen ho1- und pcyX-Gene bereits davor in marinen Datensätzen gefunden wurden und für eine Häm-Oxygenase (Ho1) und eine Ferredoxin-abhängige Bilin-Reduktase (FDBR) für die lineare Tetrapyrrol-Biosynthese kodieren, ist die Identifizierung von alaS interessant. alaS kodiert für eine mutmaßliche Aminolävulinsäure-Synthase (ALAS), ein Enzym, das den ersten Schritt der Tetrapyrrol-Biosynthese in Alpha-Proteobakterien katalysiert, um Aminolävulinsäure (ALA) zu produzieren. Dieser sogenannte C4-Weg steht im Gegensatz zum C5-Weg der ALA-Bildung, der in allen anderen Bakterien und Archaeen vorhanden ist. Dies ist der erste Nachweis eines von einem Phagen kodierten alaS in einer Kassette mit Tetrapyrrolbiosynthese assoziierten AMGs (ho1, pcyA/X), was auf eine mögliche Rolle bei der Erhöhung des Stoffwechselflusses durch den Tetrapyrrolweg schließen lässt. Die Kassette wurde in verschiedenen metagenomischen Datensätzen aus Meeres- und Süßwasserhabitaten entdeckt, aber in Süßwasser war alaS nicht direkt mit dieser Kassette assoziiert und konnte weiter entfernt auf dem Kontig gefunden werden. Durch eine Kombination aus In-silico-Strukturvorhersage und Aminosäuresequenz-Alignment erweist sich das virale alaS-Gen als funktionelles C4-Enzym, das Glycin und Succinyl-CoA für die ALA-Synthese verwendet. Dies wurde durch eine funktionelle Komplementierung mit plasmidkodiertem viralen ALAS (vALAS) bewiesen, die erfolgreich das Wachstum einer ALA-auxotrophen E. coli C5-Mutante wiederherstellte. Darüber hinaus wurde die spezifische enzymatische Bildung von ALA durch vALAS in komplementiertem Zelllysat nachgewiesen, womit zum ersten Mal gezeigt wurde, dass ein virales ALAS enzymatisch aktiv ist. Außerdem wurden die übrigen aus Süßwasser stammenden AMGs auf ihre Aktivität hin untersucht. Die virale Ho1 zeigt eine Umwandlung von Häm in Biliverdin IXα, was seine Rolle als aktive Häm-Oxygenase bestätigt. Überraschenderweise produziert das virale PcyA Phycocyanobilin (PCB), den Chromophor für die Bildung eines funktionsfähigen Phytochroms, und bestätigt damit seine Rolle als aktives PcyA-Enzym. Diese Studie gibt Aufschluss über die Verteilung und die Rolle dieser AMGs in verschiedenen ökologischen Nischen und verbessert das Verständnis der von Phagen gesteuerten Stoffwechselprozesse.