Julia Zimmer

• Die globale Plastikverschmutzung stellt ein zunehmendes Problem dar, das unsere Umwelt und unsere Gesundheit gefährdet. Daher wäre der Ersatz von konventionellem Plastik durch Bioplastik ein wichtiger Schritt zur Minimierung der Folgen. Ein biologisch abbaubares Plastik ist PHA (Polyhydroxyalkanoat), welches durch verschiedene Mikroorganismen als Speicherstoff hergestellt werden kann. Die bisherige kommerzielle Herstellung dieses Polymers erfolgt unter sterilen Arbeitsbedingungen mithilfe von Reinkulturen und teuren Substraten, wodurch das Plastik teuer und wenig konkurrenzfähig auf dem Markt ist. Zur Verbesserung der Konkurrenzfähigkeit und Senkung des Preises, kann eine Herstellung mittels Bakterienmischkulturen und Restströmen über ein mehrstufiges Verfahren eingesetzt werden. Allerdings gibt es zurzeit noch einige Hindernisse zu überwinden, um das Verfahren im industriellen Maßstab umsetzen zu können. Probleme dabei stellen beispielsweise die schwankende Quantität und Qualität des produzierten Polymers unter realen Betriebsbedingungen mit schwankenden Reststromeigenschaften dar. Zum Überwinden dieser Problematik ist ein besseres Verständnis der PHA-produzierenden Bakterienmischbiozönose und deren Reaktion auf bestimmte Betriebsweisen notwendig. Daher sollten in dieser Arbeit i) der Einfluss unterschiedlicher Betriebsparameter in der Selektion auf die Mischbiozönose und die PHA-Produktion untersucht werden und die Identifizierung von Kernorganismen stattfinden, ii) mit einer Auswahl der Betriebsparameter eine Langzeit-Selektion durchgeführt und die Stabilität der PHA-Produktion und Zusammensetzung der Biozönose untersucht werden, iii) der Einfluss unterschiedlicher Substrate in der Akkumulationsphase auf die PHA-Produktion in Verbindung mit der Zusammensetzung der Biozönose analysiert werden. Hierzu wurde ein aufeinander aufbauendes Versuchsdesign entwickelt, in welchem zunächst verschiedene Betriebsparameter in der Selektion miteinander verglichen wurden und die beste Variation für den nächsten Versuch ausgewählt wurde. Mit der Auswahl der am besten geeigneten Parameterkombination, erfolgte eine Langzeit-Selektion, in welcher zudem ein Substratwechsel stattfand. In den Selektionsversuchen wurden regelmäßige Akkumulationen zur Evaluierung der PHA-Produktionsperformance und dessen Eigenschaften durchgeführt und Proben zur Analyse der mikrobiellen Zusammensetzung genommen. Die Analyse erfolgte mittels Amplifizierung und Illumina-Sequenzierung der V3-V4-Region der bakteriellen 16S rDNA. Mit der selektierten Biomasse des Langzeitversuches wurden zusätzliche Akkumulationen mit variierendem Substrat durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass unter Verwendung der gleichen Betriebsweise eine Selektion unterschiedlicher Inokula zu ähnlich zusammengesetzten Biozönosen mit vergleichbarer PHA-Produktionsperformance führt. Die Selektionsphase führte zudem zu einer effektiven Anreicherung potenzieller PHA-Produzenten und zur Steigerung der PHA-Produktion. Dabei wurden größtenteils bereits nach 7 bis 14 Tagen hohe PHA-Gehalte und Anteile potenzieller PHA-Produzenten erreicht. Eine weitere Steigerung war jedoch in der Langzeit-Selektion bis Tag 56 erkennbar. Unter Nutzung eines Belebtschlammes einer Brauerei, eines Schlammalters von 4 d, einer Zyklusdauer von 6 h und einer Raumbelastung von ca. 1 gCSBVFA/(L*d) konnte mit versäuertem Brauereiabwasser als Substrat ein maximaler PHA-Gehalt von ca. 48 %oTS erzielt werden. Das gleiche Inokulum entwickelte sich unter Nutzung unterschiedlicher Betriebsparameter in der Selektion teils unterschiedlich, allerdings waren Überschneidungen in den dominantesten Organismen erkennbar. Zu den wichtigsten potenziellen PHA-Produzenten zählten die Gattungen Pseudomonas, Acinetobacter, Paracoccus, Comamonas, Flavobacterium, Zoogloea, Rhodobacter, Leadbetterella und Hydrogenophaga. Die Nutzung hoher Raumbelastungen (6 und 10 gCSBVFA/(L*d)) führte jedoch zu großen Unterschieden in der mikrobiellen Zusammensetzung und zu einer schlechten PHA-Produktionsperformance. Während der Langzeit-Selektion konnten kontinuierliche Veränderungen der Biozönose über die Zeit und zwischen dem Substratwechsel festgestellt werden, wobei der PHA-Gehalt jedoch vergleichbar blieb. In den anderen Selektionsversuchen konnten ebenfalls Wechsel der dominanten Organismen über die Zeit mit teils unveränderter PHA-Produktion festgestellt werden. Dies spricht für eine funktionelle Redundanz und Stabilität des Systems trotz des Einflusses stochastischer Prozesse auf die Biozönose. Die PHA-Zusammensetzung entwickelte sich zumeist über die Zeit in eine ähnliche Richtung der, durch die Substratzusammensetzung zu erwartenden, theoretischen, Zusammensetzung. Dies deutet auf eine metabolische Anpassung der Biozönose hin. Während der Akkumulationsversuche mit unterschiedlichem Substrat konnten Unterschiede im Gehalt und der Zusammensetzung an produziertem PHA, aber nicht in der bakteriellen Zusammensetzung festgestellt werden. Substrate mit Eigenschaften ähnlich denen, des in der Selektion verwendeten, führten zu höheren PHA-Gehalten oder vorhersagbareren PHA-Zusammensetzungen. Daher hängen die PHA-Produktionseigenschaften offenbar mit der metabolischen Adaption der Mischbiozönose in der Selektionsphase zusammen. Eine Erhöhung der Substratkonzentration führte zudem nur bis zu einem gewissen Grad zur Erhöhung der PHA-Produktion und eine Nährstoffzugabe hatte keinen Einfluss auf diese, es sei denn Stickstoff und Phosphor wurden zusammen zugegeben. Die Ergebnisse liefern Implikationen für weitere Untersuchungen wichtiger PHA-Produzenten zur Entwicklung von Monitoring-Strategien und zur Anpassung der Betriebsstrategien in der Selektion. Zudem liefern sie Einblicke in den Einfluss von Substratschwankungen im Verfahren und zu den Vor- und Nachteilen einer Langzeit- oder Kurzzeitselektion.
• Global plastic pollution is an increasing problem, which threatens our environment and health. Replacing conventional plastic with bioplastics would be an important step in minimizing the effects of this pollution. PHA (Polyhydroxyalkanoate) is a biodegradable polymer which can be produced by a variety of microorganisms for energy storage. The commercial PHA production is executed with the use of pure cultures and expensive feed stocks under sterile conditions. This results in a high market price of PHA and leads to lower competitiveness compared to conventional plastic. The production of PHA with mixed microbial cultures and residual streams in a multi-stage process can be used to reduce the price and to improve the competitiveness on the market. However, there are still some obstacles to overcome before the process can be implemented on an industrial scale. Problems include the fluctuating quantity and quality of the polymer produced under real operating conditions with varying residual stream properties. To overcome this, a better understanding of the PHA-producing microbial community and the reaction of the community to varying process parameters is needed. Therefore, in this work i) the influence of different operating parameters in the selection on the mixed microbial culture and the PHA production should be investigated and core organisms should be identified, ii) with the chosen operating parameters, a long-term selection should be performed and the stability of the PHA production and composition of the microbial culture should be investigated, iii) the influence of different substrates in the accumulation phase on the PHA production and the composition of the mixed microbial culture should be analyzed. A consecutive test design was developed in which different operating parameters in the selection phase were compared and the best variation was chosen for the next experiment. Once the most suitable combination of parameters had been selected, a long-term selection was performed, in which a substrate change was realized. During the selection experiments, regular accumulations were conducted to evaluate the PHA production performance and its properties. Samples for microbial composition analysis were regularly taken. For this analysis, the V3-V4 region of the bacterial 16S rDNA was amplified and sequenced via Illumina-Sequencing. Additional accumulation experiments using different substrates were conducted with the selected biomass from the long-term selection. Results showed that, using the same operating conditions, a similarly composed mixed microbial culture with a comparable PHA production capacity can be selected with inocula of different origin. The selection phase also led to an effective enrichment of potential PHA producers and to an increase in PHA production. High PHA contents and relative abundances of potential PHA producers were frequently achieved after 7 to 14 days. However, a further increase could be recognized in the long-term selection up to day 56. A maximum PHA content of approximately 48 %VSS could be achieved with activated sludge taken from a brewery, a sludge retention time of 4 d, a cycle length of 6 h and an organic loading rate of ca. 1 gCODVFA/(L*d) using a fermented brewery residual stream. Partially, the same inoculum developed differently under the use of different operating parameters in the selection phase although intersections between the dominant organisms could be observed. The genera Pseudomonas, Acinetobacter, Paracoccus, Comamonas, Flavobacterium, Zoogloea, Rhodobacter, Leadbetterella und Hydrogenophaga were among the most important potential PHA producers. However, the use of high organic loading rates (6 and 10 gCODVFA/(L*d)) resulted in more pronounced differences in microbial composition and in deteriorated PHA production performances. During long-term selection, continuous variations in mixed microbial composition could be observed over time and between substrates used. Nevertheless, the PHA production remained comparable. In the selection experiments on different operating conditions, changes in the dominant organisms over time with oftentimes unchanged PHA production were also observed. This indicates a functional redundancy and stability of the system despite the influence of stochastic processes on the microbial culture. The PHA composition usually developed in a similar direction to the theoretical composition to be expected from the substrate composition over time. This indicates a metabolic adaptation of the mixed microbial culture. During the accumulation experiments with different substrates, differences in the content and composition of PHA produced were observed, but not in the bacterial composition. Substrates with properties similar to those used in the selection resulted in higher PHA contents or more predictable PHA compositions. Therefore, PHA production characteristics may be related to the metabolic adaptation of the mixed microbial culture during selection. Furthermore, increasing the substrate concentration only led to an increase in PHA production to a certain extent and adding nutrients had no effect on this, unless nitrogen and phosphorus were added together. The results provide implications for further investigations on important PHA producers for the development of monitoring strategies and for the adaptation of operating strategies in the selection phase. They also provide insights into the influence of substrate fluctuations on the process and into the advantages and disadvantages of a long-term or short-term selection phase.