Nassim Safari

• The grey mould fungus Botrytis cinerea is a plant pathogen that attacks a wide range of host plants, causing enormous pre- and postharves damage on a large number of economically important fruits, vegetables and ornamental flowers. As a necrotroph, it quickly kills host cells and colonizes dead tissue, supported by the secretion of CWDE, cell death inducing proteins (CDIPs) and metabolites, tissue acidification and detoxification of plant defence compounds. This thesis focused on the role of CDIPs and their contribution to necrotrophic infection and killing of plant cells. The majority of CDIPs is found in the apoplast and are likely to interact with defence-related pattern recognition receptors (PRRs) that upon activation induce programmed cell death, which supports infection by B. cinerea. Based on a highly efficient CRISPR/Cas9 editing protocol, a consecutive mutagenesis was performed to eliminate all known CDIPs in a single B. cinerea strain. This resulted in series of multiple mutants lacking up to 27 CDIPs and two phytotoxic metabolites. These mutants still showed almost normal growth and differentiation in vitro but decreased virulence with increasing numbers of deleted CDIPs. Similarly, the secretomes of these mutants showed a strongly reduced phytotoxic activity compared to the wild type secretome. Genome and secretome analysis confirmed the targeted elimination of the CDIPs from the secretome and the absence of CRISPR/Cas-induced off-target mutations. The Bc29x mutant caused strongly reduced lesion formation on leaves and almost no infection of fruits of different species. Besides of the two major polygalacturonases PG1 and PG2, none of the other CDIPs made a major contribution to necrotic lesion formation on most tissues. Overexpression of the highly phytotoxic CDIP Nep1 in a multi-knockout mutant did not increase its virulence, raising doubt on a central role of CDIPs in B. cinerea infection. The remaining virulence and phytotoxicity of the secretome of the Bc29x mutant further confirmed an extraordinary degree of redundancy of secreted phytotoxic proteins in B. cinerea, and the existence of even more as yet unknown CDIPs. The search for remaining CDIPs is ongoing, with the final goal to generate a non-necrotrophic B. cinerea mutant. Based on their homology to known CDIPs, new CDIPs with low to moderate phytotoxic activity were discovered that are currently under investigation. To get insights into the plant defence pathways that are triggered by CDIPs and fungal infection, the sensitivity of plant mutants defective in the PRR coreceptors BAK1 and SOBR1, and the signaling protein EDS1 was investigated. Whereas the loss of BAK1 and SOBIR1 had no effect on infection, Arabidopsis eds1 mutants showed reduced sensitivity to B. cinerea, confirming a positive role of EDS1 in triggering the programmed cell death of the plant cells and supporting fungal infection. This is the first systematic, large-scale mutagenesis approach to address the functional redundancy of virulence factors in a filamentous fungus.
• Der Grauschimmelpilz Botrytis cinerea ist ein pflanzenpathogener Erreger, der ein breites Spektrum von Wirtspflanzen befällt und große Ernteausfälle bei einer Vielzahl wirtschaftlich bedeutender Obst-, Gemüse- und Zierpflanzenarten verursacht. Als nekrotropher Organismus tötet er die Wirtszellen schnell ab und besiedelt das abgestorbene Gewebe, unterstützt durch die Sekretion von zellwandabbauenden Enzymen (CWDE), zelltodinduzierenden Proteinen (CDIPs) und Metaboliten, Gewebeansäuerung und die Entgiftung pflanzlicher Abwehrmoleküle. Diese Dissertation konzentrierte sich auf die Rolle der CDIPs und ihren Beitrag zur Infektion und Abtötung pflanzlicher Wirtszellen. Die meisten CDIPs werden in den Apoplasten sekretiert und interagieren wahrscheinlich mit Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), die nach ihrer Aktivierung den programmierten Zelltod auslösen, wodurch die Infektion durch B. cinerea gefördert wird. Mithilfe eines hocheffizienten CRISPR/Cas9-basierten Transformationsprotokolls wurde eine sequenzielle Mutagenese durchgeführt, um sämtliche bekannten CDIPs in einem einzigen Stamm von B. cinerea auzuschalten. Dies führte zu einer Serie multipler Mutanten, denen bis zu 27 CDIPs sowie zwei phytotoxische Metaboliten fehlten. Diese Mutanten zeigten ein nahezu normales Verhalten bei Wachstum und Differenzierung in vitro, jedoch eine abnehmende Virulenz mit steigender Anzahl fehlender CDIPs. Die Sekretome dieser Mutanten zeigten entsprechend eine stark reduzierte phytotoxische Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Sekretom. Genom- und Sekretomanalysen bestätigten die gezielte Eliminierung der CDIPs aus dem Sekretom und das weitgehende Fehlen von unerwünschten CRISPR/Cas-induzierten ‚off-target‘ Mutationen. Die 29-fach-Mutante verursachte stark reduzierte Läsionsbildung auf Blättern und nahezu keine Infektion mehr auf Früchten verschiedener Pflanzenarten. Neben den zwei dominierenden Polygalacturonasen PG1 und PG2 trugen keine der weiteren CDIPs wesentlich zur Läsionsbildung auf den meisten Geweben bei. Die verbliebene Virulenz und Phytotoxizität des Sekretoms der 29-fach-Mutante offenbarte einen außergewöhnlichen Grad an Redundanz sekretierter phytotoxischer Proteine bei B. cinerea und das Vorhandensein einer bislang unbekannten Anzahl noch nicht identifizierter CDIPs. Die Suche nach den verbleibenden CDIPs wird fortgesetzt, mit dem endgültigen Ziel, eine nicht-nekrotrophe B. cinerea-Mutante zu erzeugen. Basierend auf ihrer Homologie zu bereits bekannten CDIPs wurden neue CDIPs mit geringer bis mäßiger phytotoxischer Aktivität entdeckt, die derzeit weiter untersucht werden. Um Einblicke in die pflanzlichen Abwehrmechanismen zu erhalten, die durch CDIPs und die Pilzinfektion ausgelöst werden, wurde die Empfindlichkeit von Pflanzenmutanten mit Defekten in den PRR-Corezeptoren BAK1 und SOBR1 sowie das Signalprotein EDS1 untersucht. Während der Verlust von BAK1 und SOBIR1 keine Auswirkungen auf die Infektion hatte, zeigten Arabidopsis eds1-Mutanten eine geringere Empfindlichkeit gegenüber B. cinerea, was eine positive Rolle von EDS1 bei der Auslösung des programmierten Zelltods der Pflanzenzellen und der Unterstützung der Pilzinfektion bestätigt. Diese Studie stellt den ersten systematischen und umfassenden Mutagenese-Ansatz zur Untersuchung der funktionellen Redundanz von Virulenzfaktoren in einem filamentösen Pilz dar.