Oxidative folding of proteins in the mitochondrial intermembrane space of Leishmania tarentolae

  • Mitochondrial genes encode for a few proteins. Thus, the majority of proteins has to be imported to the organelles, which is only possible in the unfolded state. The subsequent folding guarantees functionality. One of the proteins responsible for folding in the intermembrane space is Mia40, which is known in opisthokonts. No ortholog for Mia40 is known in kinetoplastida such as Leishmania tarentolae. First, already known candidates for Mia40 orthologs were investigated. In previous work Mic20 had been identified in Trypanosomes.1–4 Gene editing cassettes to knock-out or modify the gene LtaPh_3313851, which encodes the Mic20 ortholog, could not be inserted homozygously. Thus, the gene is assumed to be essential. Another protein that plays an important role in mitochondrial protein import is Erv, a known interactor of Mia40. Erv is also found in Leishmania. Two proteins of so far unknown function had been identified as potential interactors of Erv and could be candidates for Mia40 orthologs.5 Potential knock-out strains of one protein-encoding gene each were investigated. The knock-out of LtaP32.0380 was assumed to be complete and the gene dispensable. The knock-out cassette for LtaP07.0980 could be shown to be inserted heterozygously, which could indicate the essentiality of the gene. To identify new candidates for Mia40 orthologs in Leishmania tarentolae, potential substrates6 of the Mia40/Erv pathway were used as baits in the present work. Gene editing via CRISPR/Cas9 included attempts to insert knock-out or tagging cassettes to five different genes. Homozygous insertion succeeded for the C-terminal His8-tagging cassettes for LtaP19.1110, and for the N-terminal His8-tagging cassettes for LtaP25.1620 and LtaP09.1390. No homozygous gene editing could be observed for LtaP35.0210. The knock-out of LtaP04.0060 was assumed to be complete. The presence of the N-terminal His8-tagged substrate 4 (LtaP09.1390) could be shown in cell lysates. The correct position of tagged substrate 4 in the cell was confirmed. Further cell lysates were purified in pull-downs on Ni-NTA to obtain tagged substrate 4 with its interaction partners. The presence of tagged proteins in the eluates could be confirmed. To identify interacting proteins, mass spectrometry analysis was performed. In further experiments, DTT and TMAD were used to alter the redox conditions in the cells before lysis and purification. The evaluation of the data included the comparison of the proteins identified in different experiments and the comparison with potential interactors of Erv.5,7 Also, properties of Mia40 that might be conserved were considered. Two characteristic motifs of known Mia40 orthologs are a CPC and a twin CX9C motif. Thus, proteins with these or similar motifs were specifically searched for. Different candidates for Mia40 orthologs were identified and discussed.
  • Mitochondriale Gene codieren für wenige Proteine. Daher muss die Mehrheit der Proteine in diese Organellen importiert werden. Dies ist nur in ungefaltetem Zustand möglich. Nachfolgendes Falten garantiert die Funktionalität der Proteine. Ein Protein, das für die Faltung im Intermembranraum verantwortlich ist, ist Mia40, das aus Opisthokonta bekannt ist. Für Mia40 ist kein Ortholog in Kinetoplastida, wie beispielsweise Leishmanien bekannt. Zunächst wurden aus der Literatur bekannte Kandidaten für Orthologe untersucht. Als solches wurde Mic20 in Trypanosoma identifiziert.1–4 Kassetten für den Knock-out oder die Modifizierung des Gens LtaPh_3313851, das für das Mic20 Ortholog kodiert, konnten nicht homozygot eingeführt werden. Daher wurde angenommen, dass das Gen unverzichtbar ist. Ein anderes Protein, das eine wichtige Rolle im mitochondrialen Proteinimport spielt ist Erv, von dem bekannt ist, dass es sich um einen Interaktionspartner von Mia40 handelt. Erv wurde auch in Leishmanien identifiziert. Zwei Proteine mit bisher unbekannter Funktion wurden als Interaktoren von Erv identifiziert und könnten Kandidaten für Mia40 Orthologe sein.5 Stämme in denen je eines der beiden Proteine potentiell ausgeknockt werden sollte wurden untersucht. Der Knock-out des Gens LtaP32.0380 wurde als vollständig und das Gen als entbehrlich interpretiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Knock-out-Kassette für LtaP07.0980 heterozygot eingefügt war. Dies deutet auf eine Unverzichtbarkeit des Gens hin. Um neue Kandidaten für Orthologe von Mia40 in Leishmania tarentolae zu identifizieren wurden in der vorliegenden Arbeit potentielle Substrate6 des Mia40/Erv-Importwegs als Köder eingesetzt. Die genetische Manipulation mittels CRISPR/Cas9 umfasste das Einfügen von Knock-out- oder Tagging-Kassetten an fünf verschiedenen Genen. Homozygote Insertion gelang für die C-terminalen His8-Tagging-Kassetten für LtaP19.1110 und für die N-terminalen His8-Tagging-Kassetten für LtaP25.1620 und LtaP09.1390. Keine homozygote Genmanipulation konnte für LtaP35.0210 beobachtet werden. Als vollständig wurde der Knock-out von LtaP04.0660 angesehen. Das N-terminal His8-getaggte Substrat 4 (LtaP09.1390) konnte in Zelllysaten nachgewiesen werden. Die korrekte Lokalisierung von getaggtem Substrat 4 in der Zelle wurde bestätigt. Weitere Zelllysate wurden aufgereinigt in Pull-downs an Ni-NTA, um das getaggte Substrat 4 mit seinen Interaktionspartnern zu erhalten. Getaggte Proteine konnten in den Eluaten nachgewiesen werden. Um die Interaktoren zu identifizieren wurden massenspektrometrische Analysen durchgeführt. In weiteren Experimenten wurden DTT und TMAD verwendet um die Redoxbedingungen der Zellen zu manipulieren, bevor die Zellen lysiert und aufgereinigt wurden. Die Auswertung der identifizierten Proteine beinhaltete den Vergleich verschiedener Experimente untereinander und mit den Interaktoren von Erv.5,7 Auch Eigenschaften von Mia40, die konserviert sein könnten wurden berücksichtigt. Zwei charakteristische Motive in den bekannten Mia40 Orthologen sind ein CPC- und ein doppeltes CX9C-Motiv. Daher wurde gezielt nach Proteinen mit diesen oder ähnlichen Motiven gesucht. Verschiedene Kandidaten für Mia40 Orthologe wurden identifiziert und diskutiert.

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Metadaten
Author:Luzia Schneider
URN:urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-69129
DOI:https://doi.org/10.26204/KLUEDO/6912
Advisor:Marcel Deponte
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Date of Publication (online):2022/08/11
Year of first Publication:2022
Publishing Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2022/08/02
Date of the Publication (Server):2022/08/11
Page Number:XXII, 105
Faculties / Organisational entities:Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
Licence (German):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)