Mechanistische Charakterisierung der Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen von Glutaredoxinen und redox-sensitivem grün-fluoreszierendem Protein

  • Peroxiredoxine sind Peroxidasen, die in allen Reichen der Lebewesen vorkommen. Sie gehören zu den häufigsten Proteinen in einer Zelle und spielen eine wichtige Rolle im Redox-Metabolimus, dienen als Signalüberträger und können als Chaperone fungieren. Das hier untersuchte Peroxiredoxin 6 aus Plasmodium falciparum (PfPrx6) hat in in vitro Tests bereits eine große Aktivität bei der Reduktion von Hydroperoxiden gezeigt, jedoch keine Reaktion mit gängigen Reduktionspartnern, sodass der Mechanismus der Regeneration aus seiner oxidierten Form bis heute ungeklärt ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein PFPRX6-HIS8-GFP-Konstrukt in das Genom des Malariaerregers Plasmodium falciparum integriert. Die Integration konnte hierbei nur auf DNA-Ebene bestätigt werden. In zukünftigen Experimenten muss daher im nächsten Schritt die Anwesenheit des Protein-Konstrukts nachgewiesen werden. Hiernach kann das Konstrukt durch einen Pulldown aus dem Zelllysat isoliert und mithilfe von Massenspektrometrie untersucht werden, mit welchen Proteinen das PfPrx6 interagiert. Findet sich ein geeigneter Kandidat, kann eine folgende in vitro Studie bestätigen oder widerlegen, ob dieser das PfPrx6 effizient reduzieren kann. Neben Peroxiredoxinen spielen Glutaredoxine (Grx) eine zentrale Rolle in der Homöostase des Redox-Milieus einer Zelle. Trotz großer struktureller Ähnlichkeit zueinander werden sie nach ihrer Funktion in zwei Klassen unterteilt: aktive Klasse 1 Glutaredoxine, welche enzymatisch die Reduktion von oxidierten Zellbestandteilen katalysieren, und redox-inaktive Klasse 2 Glutaredoxine, die wichtig für die Synthese und den Transfer von Eisen-Schwefel-Clustern sind. In vergangenen Studien wurde gezeigt, dass die Reaktion eines Grx mit einem glutathionylierten Substrat nach einem Ping-Pong-Mechanismus verläuft, also in zwei getrennte Schritte unterteilt ist. In der oxidativen Halbreaktion bindet der Gluthathion-Rest des Substrats an die Glutathion-Scaffold-Site („Glutathion-Gerüst-Zentrum“) und transferiert das Glutathion auf das Grx. In der hierauf folgenden reduktiven Halbreaktion bindet ein zweites Molekül reduziertes Glutathion (GSH) in die Glutathion-Activator-Site („Glutathion-Aktivierungs-Zentrum“) und regeneriert unter Freisetzung von oxidiertem Glutathion (GSSG) das reduzierte Glutaredoxin. In dieser Arbeit wurden Aminosäuren des Klasse 1 ScGrx7 und des Klasse 2 HsGrx5 ausgetauscht, um die Motive zu identifizieren, die ein Grx aktiv oder inaktiv machen. Das Einfügen der Mutationen R152W und R153P in ScGrx7 verlangsamte die oxidative Halbreaktion auf etwa 20 % der Aktivität des Wildtypenzyms, hatte aber keinen Einfluss auf die reduktive Halbreaktion. Somit ist davon auszugehen, dass diese Reste Teil der Glutahion-Scaffold-Site sind. Ein weiterer Unterschied der Grx-Varianten ist eine fünf Aminosäuren lange Schleife im HsGrx5, welche in aktiven Glutaredoxinen fehlt. Es wurde eine ScGrx7loop-Mutante erstellt, die einen Verlust von mehr als 99 % ihrer Aktivität aufweist. Das Ausschneiden dieser fünf Aminosäuren in HsGrx5 konnte hingegen dessen katalytische Funktion aktivieren. Somit konnte gezeigt werden, dass diese Schleife einer der Hauptunterschiede der beiden Glutaredoxinklassen ist und diese als eine Art An- und Ausschalter der katalytischen Aktivität dient. Durch das Verwenden des redox-sensitiven grün-fluoreszierenden Proteins 2 (roGFP2) als Elektronendonor und Reporterprotein konnte ebenfalls die direkte Reduktion von GSNO, einem Derivat von Glutathion, das hauptsächlich als Stickoxidspeicher gesehen wird, durch PfGrx nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis kann auf die Beteiligung von Glutaredoxinen an der NO-Signalkette hinweisen. RoGFP2 wird bereits in weiten Bereichen der Redox-Forschung eingesetzt. Es besitzt Cysteine an den Stellen 151 und 208, die eine Disulfidbrücke ausbilden können. Je nach Oxidationszustand dieser Cysteine ändert das roGFP2 seine spektralen Eigenschaften. Zuletzt wurde es meist als Reportereinheit in Fusionskonstrukten mit Glutaredoxinen oder Peroxiredoxinen, die als Sensorproteine dienen, eingesetzt. Diese Konstrukte können in zellulären Tests genutzt werden, beispielsweise zur Bestimmung lokaler Peroxidkonzentrationen, zur Untersuchung des Glutathion-Redoxstatus oder als Screening-Methode für Aktivitätsbestimmungen und Struktur-Funktions-Analysen der fusionierten Sensorproteine. In dieser Arbeit wurde die Reaktion von roGFP2 und Grx aus Plasmodium falciparum (PfGrx) untersucht, sowohl als Fusionskonstrukt, als auch als getrennte Einzelproteine. Um sowohl den Monothiol- als auch den Dithiolmechanismus der Glutaredoxine zu verstehen, wurden die Mutanten PfGrxC32/88S (Monothiol) und PfGrxC88S (Dithiol) erstellt, sowie die roGFP2-Mutanten roGFP2C151S und roGFP2C208S. Es konnte gezeigt werden, dass die Oxidation des roGFP2 nur durch den Übertrag von Glutathion effizient verläuft, wobei der Transfer selbst im Fusionskonstrukt bei großen Substratkonzentrationen geschwindigkeitsbestimmend sein kann. Der Übertrag eines nicht-Glutathion Disulfids von PfGrxC88S auf roGFP2 verläuft nur sehr langsam. In dynamischen in cellulo Tests, die einen solchen Übertrag untersuchen wollen, muss also mit großen Beeinflussungen der Daten durch effizientere, glutathionabhängige Nebenreaktionen gerechnet werden. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Reduktion von roGFP2 als Disulfidsubstrat sehr langsam verläuft und nur in Anwesenheit von GSH stattfinden kann. Ein Kompetitionstest mit GSMe (S-Methyl-Glutathion) zeigt, dass das Grx hierfür ein Molekül GSH rekrutiert und nicht etwa zufällig durch GSH glutathionylierte Proteine angreift. Obwohl das Dithiol-Grx hierbei effizienter ist, kann auch das Monothiol-Grx auf diese Weise Disulfidsubstrate wie roGFP2 reduzieren. Die Reduktion der glutathionylierten roGFP2 Monothiol-Mutanten konnte effizient von beiden Grx-Varianten katalysiert werden, auch in Abwesenheit von GSH. PfGrxC88S weist hierbei allerdings eine größere Geschwindigkeit auf. Somit scheint das Cys32 des PfGrx die Konformation des Cys29 und damit dessen Reaktivität zu beeinflussen.

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Metadaten
Author:Fabian Geissel
URN:urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-69466
DOI:https://doi.org/10.26204/KLUEDO/6946
Advisor:Marcel Deponte
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Date of Publication (online):2022/09/19
Year of first Publication:2022
Publishing Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2022/09/05
Date of the Publication (Server):2022/09/20
Page Number:137
Faculties / Organisational entities:Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
Licence (German):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)