Vanessa Burre

• Throughout their lives organisms encounter a wide range of complex sensory stimuli and must be able to flexibly adjust their behavior. Innate behavior, which is genetically programmed, differs from learned behavior, which relies on experience. The output of both behavioral pathways is integrated to generate appropriate responses to environmental cues. The detection and evaluation of these stimuli are essential for survival and show remarkable similarities between vertebrates and insects, especially in the olfactory system. Memory enables organisms to use past experiences by storing relevant information that can be accessed later to guide behavior and adapt to future changes. In Drosophila melanogaster the mushroom body (MB) acts as the key brain region for learning and memory formation. Through associative learning, where sensory cues are linked with either positive or negative reinforcement, behavioral changes can become lasting. The establishment of long-term memory in the MB involves local molecular adaptation and synaptic remodeling. In this thesis I investigate the formation and function of memory traces in the olfactory system of the fruit fly. Central to this study is the CRE-activity-dependent memory engram label (CAMEL)-tool, a genetic reporter that labels and manipulates memory-relevant Kenyon cells (KCs). I demonstrated that the number of fluorescently labeled CAMEL cells was modulated dynamically by sensory input. Environmental enrichment led to a significant increase in CAMEL-labeled KCs within the MB, indicating that CAMEL activity reflects experience-dependent memory encoding. Optogenetic reactivation of these CAMEL-cells after exposure to specific stimuli resulted in behavioral changes, confirming their functional relevance. To investigate molecular changes within individual engram cells, I combined the fluorescent non-canonical amino-acid tagging (FUNCAT) technique with the CAMEL-tool to visualize newly synthesized proteins. FUNCAT relies on the incorporation of a methionine analog into nascent proteins, which can subsequently be fluorescently labeled using bioorthogonal click chemistry. This approach enables sensitive and specific detection of protein synthesis at the single-cell level, allowing precise analysis of translational activity within defined neuronal populations without relying on conventional antibody staining. I established an optimized immunohistochemical labeling protocol to improve the detection of sparsely labeled neuronal populations by increasing signal-to-noise ratio and overall staining consistency. This enabled more reliable detection of sparsely labeled neuronal populations and helped to overcome limitations observed with previous protocols. In an artificial aversive conditioning paradigm the odor cue was replaced by optogenetic activation of CAMEL cells during training. In the subsequent light preference test using the circular arena, we were not able to recall artificial aversive memory using this approach. Finally, I optogenetically manipulated dopaminergic signaling pathways by expressing a light-activatable variant of the dopamine receptor D1R1 in MB neurons. I confirmed proper subcellular localization of the receptor, and behavioral experiments demonstrated that D1R1 function in KCs is required for learning. However, when the electric shock was replaced by light-induced activation of D1R1 during odor presentation, this artificial activation alone was insufficient to induce associative memory formation.
• Im Verlauf ihres Lebens sind Organismen einer Vielzahl komplexer Sinneseindrücke ausgesetzt und müssen ihr Verhalten flexibel anpassen können. Angeborenes Verhalten, das genetisch festgelegt ist, unterscheidet sich von erlerntem Verhalten, das auf Erfahrung basiert. Angeborenes und erlerntes Verhalten wirken zusammen, um passende Reaktionen auf Umweltreize zu erzeugen. Die Wahrnehmung und Bewertung dieser Reize ist für das Überleben essenziell und zeigt bemerkenswerte Parallelen zwischen Wirbeltieren und Insekten – insbesondere im olfaktorischen System. Gedächtnis ermöglicht es Organismen, frühere Erfahrungen zu speichern und diese bei Bedarf abzurufen, um ihr Verhalten zu steuern und sich an neue Situationen anzupassen. Bei Drosophila melanogaster übernimmt der Pilzkörper (mushroom body, MB) eine zentrale Rolle bei Lernprozessen und der Gedächtnisbildung. Durch assoziatives Lernen, bei dem Sinneseindrücke mit positiver oder negativer Verstärkung verknüpft werden, können Verhaltensänderungen dauerhaft etabliert werden. Die Ausbildung von Langzeitgedächtnis im MB geht mit synaptischer Plastizität und molekularen Anpassungen einher. In dieser Arbeit untersuche ich die Bildung und Funktion von Gedächtnisspuren im olfaktorischen System der Fruchtfliege. Im Mittelpunkt steht das CAMEL-Werkzeug (CRE-activity–dependent memory engram label, CAMEL) – ein genetischer Reporter, der Kenyon-Zellen (KCs) auf Basis von CRE-Aktivität markiert und manipuliert, wenn sie an der Gedächtnisbildung beteiligt sind. Ich konnte zeigen, dass die Anzahl Fluoreszenz markierter CAMEL-Zellen dynamisch durch sensorische Reize beeinflusst wird. Umgebung mit erhöhter sensorischer Stimulation führte zu einer signifikanten Zunahme CAMEL-positiver KCs, was darauf hindeutet, dass CAMEL-Aktivität erfahrungsabhängige Gedächtnisprozesse widerspiegelt. Die optogenetische Reaktivierung dieser CAMEL-Zellen nach definierter Reizexposition führte zu Verhaltensänderungen, was ihre funktionelle Relevanz bestätigt. Um molekulare Veränderungen in einzelnen Engrammzellen zu untersuchen, kombinierte ich das CAMEL-Werkzeug mit der FUNCAT-Technik (fluorescent non-canonical amino-acid tagging, FUNCAT) zur Visualisierung neu synthetisierter Proteine. FUNCAT basiert auf dem Einbau eines Methionin-Analogons in naszierende Proteine, die anschließend über bioorthogonale Click-Chemie fluoreszent markiert werden können. Diese Methode erlaubt eine sensitive und spezifische Detektion von Proteinsynthese auf Einzelzellebene und ermöglicht eine präzise Analyse translationaler Aktivität in definierten neuronalen Populationen ohne den Einsatz konventioneller Antikörperfärbungen. Ich etablierte ein optimiertes immunhistochemisches Färbeprotokoll, dass das Kontrastverhältnis zwischen Signal und Hintergrund erhöht. Dadurch wurde die Detektion schwach markierter neuronaler Populationen zuverlässiger und Einschränkungen früherer Protokolle konnten überwunden werden. In einem künstlichen aversiven Konditionierungsparadigma wurden die Elektroschocks während des Trainings beibehalten, der Geruchsreiz jedoch durch optogenetische Aktivierung von CAMEL-Zellen ersetzt. Im anschließenden Lichtpräferenztest innerhalb der zirkularen Arena konnte auf diese Weise jedoch kein aversives Gedächtnisverhalten ausgelöst werden. Zur Manipulation dopaminerger Signalwege exprimierte ich eine lichtaktivierbare Variante des Dopaminrezeptors D1R1 in Neuronen des MB. Die korrekte subzelluläre Lokalisation wurde bestätigt, und Verhaltensexperimente zeigten, dass D1R1 in KCs für Lernprozesse erforderlich ist. Wenn jedoch der Elektroschock durch lichtinduzierte Aktivierung von D1R1 während der Geruchsdarbietung ersetzt wurde, war diese künstliche Aktivierung allein nicht ausreichend, um eine assoziative Gedächtnisbildung zu induzieren.