Patrick Marx

• Das Zwei-Komponenten System CiaRH beeinflusst mit der β-Lactamresistenz, Kompetenz, Autolyse, Bakteriocinproduktion und Virulenz eine Vielzahl an Phänotypen in Streptococcus pneumoniae und ist daher von großer physiologischer Bedeutung. Es setzt sich aus der membrangebundenen Sensorkinase CiaH und dem cytoplasmatisch lokalisierten Response Regulator CiaR zusammen. Das CiaRH System ist unter sehr vielen Wachstumsbedingungen aktiv. CiaH ist allerdings für die Aktivierung von CiaR unter bestimmten Bedingungen verzichtbar. CiaR ist jedoch in seiner phosphorylierten Form aktiv, was die Frage nach einer alternativen Phosphatquelle für CiaR aufwirft. Der sog. Crosstalk durch eine fremde Sensorkinase oder niedermolekulare Phosphodonoren wie Acetylphosphat stellen mögliche Wege zur alternativen Phosphorylierung von CiaR dar. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden Gene des Acetylphosphat-Stoffwechsels inaktiviert, was zu einer Änderung der Produktion von Acetylphosphat führen sollte. Anschließende Messungen der zellulären Acetylphosphatmenge und der CiaR-abhängigen Promotoraktivitäten in Abwesenheit der Sensorkinase CiaH zeigten klar, dass mit sinkendem Acetylphosphat auch die CiaR-vermittelte Genexpression reduziert wurde. Diese Korrelation legt den Schluss nahe, dass Acetylphosphat tatsächlich den wesentlichen alternativen Phosphodonor für CiaR darstellt. Allerdings wurden auch Hinweise für geringfügigen Crosstalk durch eine andere Sensorkinase erhalten. Im Zuge dieser Experimente ergab sich weiterhin, dass ein Enzym des Acetylphosphat-Stoffwechsels, die Acetatkinase, eine besondere Rolle bei der alternativen Phosphorylierung von CiaR spielt. Eine Reihe von Befunden legt den Schluss nahe, dass Acetatkinase und CiaR möglicherweise interagieren. Eine solche regulatorische Rolle der Acetatkinase ist bisher nicht beschrieben. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die CiaR-Aktivität durch die Bifunktionalität von CiaH auf nahezu konstantem Niveau gehalten wird. Dabei kann wahrscheinlich Acetat, ein exkretiertes Endprodukt des Acetylphosphat-Stoffwechsels, zur Stimulierung der Phosphataseaktivität von CiaH dienen. Dies könnte von physiologischer Bedeutung sein, um eine von Acetylphosphat ausgehende Phosphorylierung von CiaR durch Acetat im Medium durch Dephosphorylierung zu begrenzen. Somit könnten Acetylphosphat und Acetat Gegenspieler zur Regulation der CiaR-Aktivität darstellen. Ein einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde auf die Auswirkungen von Mutationen in CiaH auf die CiaR-Aktivität eingegangen. Das CiaRH-System wurde als erste Nicht-PBP-Resistenzdeteminante in β-lactamresistenten Labormutanten von S. pneumoniae R6 entdeckt, wobei eine Mutation im Sensorkinasegen ciaH (ciaH306, T230P) eine Erhöhung der CiaR-abhängigen Genexpression vermittelte. Weitere ciaH-Mutationen wurden in anderen spontanresistenten Labormutanten beschrieben. Die Laborallele vermitteln eine Steigerung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität zwischen vier- und 26-fach. Phänotypische Folgen sind die Verringerung der β-Lactamsuszeptibilität, der Verlust der Kompetenz und verändertes Wachstum von S. pneumoniae R6. Im Zuge dieser Arbeit wurden zum ersten Mal veränderte ciaH-Allele in klinischen Pneumokokken-Isolaten identifiziert und charakterisiert. Es zeigte sich eine Verbreitung in Isolaten der Serotypen 6, 7, 9, 19 und 23. Im Gegensatz zu den Laborallelen vermitteln die klinischen Allele eine bis zu dreifache Erhöhung der CiaR-abhängigen Promotoraktivität. Lediglich das Allel ciaHTpVT beeinflusst die Phänotypen β-Lactamresistenz und Kompetenz. Weiterhin erfolgte die Charakterisierung der Kinase- und Phosphataseaktivitäten der klinischen ciaH-Allele. Hierbei zeigten sich Abweichungen der Stärken beider Funktionen, wobei für ciaH306 ein Phosphatasedefekt festgestellt wurde.