Max Johannes Carlsson

• Methyleugenol (ME) ist ein nahrungsrelevanter, sekundärer Pflanzeninhaltsstoff und gehört zur Gruppe der Phenylpropanoide. Nach oraler Aufnahme wird es in der Leber metabolisiert und bildet durch Aktivierung über Cytochrom P450-Enzyme (CYPs) und Sulfotransferasen (SULT) DNA-Addukte. In Nagerversuchen konnte ME als kanzerogen identifiziert werden. Jedoch ist über die zellulären Effekte, die durch die DNA-Adduktbildung ausgelöst werden bisher wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die ME-induzierten Effekte in der humanen Hepatoblastomlinie HepG2, sowie in wildtypischen und Nukleotidexzisionsreparatur (NER)-defizienten primären murinen Hepatozyten (pMH) untersucht. Da HepG2 kaum CYP-Enzyme exprimieren, wurde für die Untersuchungen der Hauptmetabolit 1‘-Hydroxymethyleugenol (OHME) verwendet. Die Adduktbildung durch OHME in den verwendeten Testsystemen wurde massenspektrometrisch quantifiziert. In den Assays konnte nach 24 h kein Unterschied in den Adduktleveln von wildtypischen und NER-defizienten pMH festgestellt werden. In einem Reparaturassay in HepG2 konnte gezeigt werden, dass nach 24 h nur ca. 50 % der induzierten ME-Addukte repariert werden und die verbleibenden Addukte über 72 h persistieren. Zur Untersuchung des OHME-induzierten Zelltods wurde zunächst gezeigt, dass der Metabolit zeit- und konzentrationsabhängig Apoptose in HepG2 auslöst. Das Tumorsuppressorprotein p53 wird nach OHME-Inkubation in HepG2 als auch in pMH induziert und konnte durch Verwendung spezifischer pharmakologischer Inhibitoren und siRNA-vermitteltem p53-Knockdown als Schlüsselprotein der OHME-induzierten Apoptose identifiziert werden. In Übereinstimmung mit der beobachteten p53-Akkumulation konnte eine Induktion von p21, welches einen Zellzyklusarrest einleitet, auf Gen- und Proteinebene nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die transkriptionelle Induktion der proapoptotischen BH3only-Proteine Puma und Noxa demonstriert. Mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie konnte nachfolgend eine Aktivierung des proapoptotischen Effektors Bax demonstriert werden, was die Bildung von Poren in der äußeren mitochondriellen Membran und die Freisetzung von Cytochrom C induziert. Dies führte zur intrinischen Apoptose, was durch Nachweis der Caspase 9 und -3 Spaltung, sowie Caspase 3/7-Aktivitätsmessung belegt wurde. Des Weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass OHME das BH3only-Protein Bim induziert, jedoch stellt die genaue Rolle dieses Proteins noch einen Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen dar. Im Verlauf der Arbeit konnte eine Bim-defiziente HepG2-Linie verwendet werden, jedoch wurden hier verschiedene genetische Differenzen zu den standardmäßig verwendeten HepG2 festgestellt, welche die Verwendung dieser Zelllinie stark erschweren. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Dissertation erstmals der durch OHME-induzierte Apoptosemechanismus umfassend aufgeklärt werden. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass in HepG2-Zellen nur eine unvollständige Reparatur der OHME-induzierten Addukte erfolgt und erste Untersuchungen zum Thema des induzierten Reparaturmechanismus wurden durchgeführt. Die Signifikanz von ME als Humankanzerogen wurde in früheren Studien an humanen Leberbiopsien gezeigt, hier konnten in allen untersuchten Biopsien ME-Addukte nachgewiesen werden. Die Aufklärung des durch ME induzierten Apoptosemechanismus leistet einen Beitrag zum besseren Verständnis der zellulären Mechanismen, die durch solche Kanzerogene ausgelöst werden und kann in weiteren regulatorischen Maßnahmen in Betracht gezogen werden. In Zukunft sollte vorallem das Thema der persistierenden DNA-Addukte genauer untersucht werden, jedoch verbleiben auch noch einige Fragen zum ME-induzierten Apoptosemechanismus.
• Methyleugenol (ME) is a foodborne, secondary plant constituent, which belongs to the group of phenylpropenes. After oral consumption, it undergoes a hepatic metabolism via Cytochrome P450s (CYP) and sulfotransferases (SULT) that finally leads to the formation of DNA adducts. ME was identified as carcinogenic in different rodent studies. However, the cellular mechanisms that occur after DNA adduct formation are only incompletely understood. In the present work the ME-induced effects were studied in the hepatoblastoma cell line HepG2 as well as in wildtype and nucleotide excision repair (NER)-deficient primary murine hepatocytes (pMH). Since HepG2 scarcely express CYP-enzymes the primary metabolite 1‘-hydroxymethyleugenol (OHME) was used in the experiments. Adduct formation was quantified in the test systems via mass spectrometry. No significant differences in the DNA adduct levels in wild type and NER-deficient pMH were found after 24 h. In a recovery assay performed in HepG2 it was shown that only about 50 % of the induced DNA adducts are repaired after a recovery time of 24 h. Interestingly, the remaining adduct level persisted for up to 72 h. Subsequently, OHME was shown to induce apoptotic cell death in a time- and dose-dependent manner in HepG2. The tumor suppressor protein p53 was induced in HepG2 and pMH after OHME-incubation and was identified as key player in OHME induced apoptosis by using pharmacological inhibitors and transient p53-knockdown. In accordance to p53 accumulation, induction of p21, which induces cell cycle arrest, could be observed on gene and protein level. Additionally, the expression of BH3-only proteins Puma and Noxa was transcriptionally increased. Furthermore, an activation of the proapoptotic effector Bax by OHME was revealed by confocal laser scanning microscopy, which led to mitochondrial outer membrane pore (MOMP) formation and leakage of cytochrome c. This resulted in caspase-9 and -3 cleavage, as assessed via western blot and activity assay. Additionally, an induction of the BH3-only protein Bim was identified within this work, whereas the concrete role of Bim in the OHME-induced effects is unclear at this point. We obtained a Bim-deficient HepG2 line, but were able to identify differential genetic responses to OHME in this line in comparison to our default HepG2-line, that hinder the use of the bim-deficient line. Taken together, within this work the comprehensive mechanism for OHME-induced apoptosis in liver cells was elucidated for the first time. Additionally, we showed that adduct repair is incomplete in HepG2 and made first advances towards the topic of DNA adduct repair. The relevance of ME as a human carcinogen was demonstrated in earlier studies, where ME-adducts could be detected in a set of human liver biopsies. The clarification of the ME-induced apoptosis mechanism adds to the understanding of cellular effects that are induced by such carcinogens and may contribute to further regulatory decisions. In the future especially, the topic of persistant DNA adducts should be investigated, whereas there are still some open questions concerning ME-induced apoptosis.