Catharina Marianne Blinn

• Eisen-Schwefel-(Fe/S)-Cluster-haltige Proteine sind in allen Domänen des Lebens vertreten und gehören zu den wichtigsten Metallocofaktoren. Eines der Hauptaufgabengebiete von Fe/S-Proteinen stellt der Elektronentransport dar. Sie sind aber auch an einer Vielzahl von enzymatischen oder regulatorischen Funktionen beteiligt. Bis heute sind ca. 90 Fe/S-Proteine im Menschen bekannt und es werden verschiedene, schwerwiegende Erkrankungen mit Defekten dieser Proteine oder deren Biogenese in Verbindung gebracht. In der Bäckerhefe S. cerevisiae sind nach der yeast genome database 39 Proteineinträge als Fe/S-Cluster bindend dotiert, jedoch sind bis heute noch etwa 10 % des Hefeproteoms nicht charakterisiert. Untersuchungen zu Fe/S-haltigen Proteinen im Modellorganismus Hefe können zum Verständnis komplexer Stoffwechselwege in höheren Eukaryoten einen entscheidenden Beitrag liefern. Die beiden [2Fe-2S]-Proteine Apd1 und Aim32 aus S. cerevisiae wurden mittels verschiedener in vivo resp. in vitro Methoden in dieser Arbeit näher untersucht. Im ersten Schritt wurden verschiedene Wachstumsexperimente zur Phänotypisierung von Δaim32 und Δapd1 durchgeführt. Durch zu Hilfenahme einer chemogenomischen Datenbank konnten für Δapd1-Hefezellen und durch weitere Modifikationen auch für Δaim32 Wachstumsbedingungen gefunden werden, unter denen diese Gene essenziell sind. Mittels einer Mutagenesestudie wurden mit dem angepassten chemogenomischen Screen die Liganden des [2Fe-2S]-Clusters für Aim32 und Apd1 in vivo identifiziert. Bis heute ist der Zusammenhang zwischen der CIA-Maschinerie und dem Einbau von [2Fe 2S]-Clustern noch nicht aufgeklärt. Durch Ergebnisse dieser Arbeit konnten erstmals Hinweise auf den CIA-Maschinerie-abhängigen Einbau des [2Fe-2S]-Clusters durch die ESR-Spektroskopie gewonnen werden. Das Protein Aim32 wurde nach heterologer Proteinexpression in E. coli spektroskopisch untersucht. Mößbauer- und ESR-Spektren wiesen eine hohe Similarität zu jenen von Apd1 auf und beide Proteine wurden Gründungsmitglieder einer neuen Klasse von [2Fe 2S]-Proteinen. Die Clusterliganden von Aim32 konnten in vitro identifiziert werden und durch Austausch der clusterbindenden Histidine zu Cysteinen wurde eine Änderung der ESR-Parameter detektiert, was zusammen mit den Mößbauerspektren des Proteins einen unabhängigen Nachweis für zwei Histidin-Reste in der Clusterkoordination darstellt. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Protein aus Thermomonospora curvata näher untersucht. Das Protein zeichnet sich durch die Anwesenheit einer Sequenz des HXGGH-Motivs von Aim32/Apd1 aus, jedoch ist hier das zweite Histidin durch ein Aspartat ersetzt. UV/Vis-, ESR- und Mößbauerspektroskopie belegen die Einzigartigkeit dieses Proteins. Durch Mutagenese der clusterbindenden Aminosäuren in alternative Liganden konnte die Koordination eines [2Fe-2S]-Clusters durch zwei Cysteine, ein Aspartat und ein Histidin spektroskopisch belegt werden. Diese Arbeit lieferte grundlegende Erkenntnisse zu einer neuen Klasse von [2Fe-2S]-Proteinen mit flexibler Koordination.