Nadine Duppe

• Das Hauptinteresse dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung des Eisen–Schwefel–Proteins Mak16 aus Saccharomyces cerevisiae. Mittels Koexpression von Mak16 mit seinem gekürzten Interaktionspartner Rpf1 konnte ein stabiler Proteinkomplex isoliert werden. Diese Komplexbildung wurde durch Größenausschlusschromatographie analysiert. Anschließend konnte in vitro mittels biochemischen Methoden, durch UV/Vis–, ESR– und Mößbauer–Spektroskopie, die Anwesenheit eines [4Fe–4S]–Clusters im Mak16/Rpf1–Komplex gezeigt werden. Die funktionelle Analyse der Cysteinreste von Mak16 wurde mit Plasmid–kodierten Einzel– und Doppelmutanten in vivo mittels Tüpfeltest durchgeführt, bei denen die Cysteinreste im N–Terminus von Mak16 in Alanine mutiert wurden. Nach der Depletion des endogenen Mak16 waren die C28A– und die C43A–Mutanten nicht in der Lage, die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten und wurde deswegen als essenziell identifiziert. Die C38A–Mutante rettete den Wachstumsdefekt nur teilweise, während die Mutante C15A das Wildtyp–Wachstum fast komplett wiederherstellen konnte. Die Wirkung der Doppelmutation C15A/C38A auf das Zellwachstum führte unter nicht–permissiven Bedingungen zu einem verstärktem Wachstumsdefekt im Vergleich zur C38A–Mutante. Durch die Isolierung und Aufreinigung der Mak16 Cystein–Mutanten–Komplexe mit gekürztem Rpf1 in vitro konnten diese ebenfalls spektroskopisch charakterisiert und als Liganden identifiziert werden. Zusammenfassend sind die vier Cysteinreste: C15, C28, C38 und C43 entscheidend für die Eisen–Schwefel–Cluster–Koordination in Mak16, während die beiden nicht konservierten Cysteinreste C55 und C108 nicht Teil der Metallbindung sind. Um die Rolle des Eisen–Schwefel–Clusters in der Ribosomenbiogenese auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurden mehrere in vivo Analysen durchgeführt. Dabei wurde die Auswirkung von depletierten CIA–Maschinenproteinen in Verbindung mit einer eingeschränkten Eisen–Schwefel–Cluster–Koordination in einer Mak16–Mutante (C38A) auf den Phänotyp und dabei das Konzept der synthetischen Letalität untersucht. Für diese Studien wurden galaktose–regulierbare Stämme entwickelt, die sowohl den Promotor von MAK16 als auch die Promotoren der CIA–Maschinenproteine unter die Kontrolle von GAL–Promotoren stellten. Die Ergebnisse zeigten, dass es eine funktionelle Korrelation zwischen den getesteten CIA–Maschinenproteinen und Mak16 gibt und dass der Phänotyp der Mak16–Mutante eng mit dem fehlerhaften Einbau vom Eisen–Schwefel–Cluster verbunden ist. Die Herunterregulierung der einzelner CIA–Faktoren führte dabei zum Zelltod der Mak16–Mutante. Interaktionsstudien in vivo mit Eisen–Schwefel–Cluster–Koordination beeinträchtigten Mak16–Mutanten und Rpf1 zeigten im Vergleich zu Wildtyp–Mak16 und Rpf1 mittels Immunpräzipitation, dass Apo–Mak16 mit Rpf1 keine Bindung eingehen kann, wohingegen der Wildtyp mit Rpf1 interagiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit eines Eisen–Schwefel–Clusters in Mak16 sehr wahrscheinlich essenziell für die Stabilität von Mak16 selbst und indirekt für die Bindung mit Rpf1 ist. Anhand von Redox–Stresstests in vivo mit Hefezellen, wurde die Auswirkung von Paraquat, H2O2, DTT und Vitamin K3 auf den Phänotyp von Wildtyp–Mak16 und auf eine Mak16–Mutante mit Wachstumsdefekt, C38A, anhand Tüpfeltests bewertet. Mittels dieser Studien konnte sowohl ein dosisabhängiger (DTT), als auch ein substratabhängiger Effekt (H2O2, Vitamin K3) auf das Wachstum der Zellen beobachtet werden. Um den dosisabhängigen inhibitorischen Charakter von Vitamin K3 während der Wachstumsphase zu untersuchen, wurden mit Hilfe von Wachstumskurven die Verdopplungszeiten der Zellen bestimmt. Die Mutantenzellen und die Wildtypzellen wiesen dabei eine vergleichbare Verdopplungszeit auf, jedoch wiesen die stressinduzierten Mak16–Mutantenzellen eine längere Lag–Phase auf. Dies bedeutet, dass die Eisen–Schwefel–Cluster–Koordination beeinträchtigten Mak16–Zellen eine längere Zeit benötigen um sich den Stressbedingungen anpassen zu können, anschließend jedoch ein Wachstum aufwiesen wie stressinduzierte Mak16–Wildtypzellen. Dies lässt eine nützliche biologische Funktion von Mak16 in der Regulation der Ribosomenbiogenese vermuten. Zu den besonderen Merkmalen von Mak16 gehört neben dem [4Fe4S]–Cluster, die Ähnlichkeit zur ribosomalen L28e Proteinfamilie im N–Terminus und die unmittelbare Nähe zu dem Expansionssegment ES7a der ribosomalen RNA 25S. Um den Einfluss von Mak16 auf die rRNA zu untersuchen, wurden Protein–RNA Interaktionsstudien durchgeführt. Nach erfolgreicher Isolierung des rRNA–Expansionssegments ES7a zeigten erste Ergebnisse mittels dem EMSA–Assay eine Bindung zwischen der rRNA ES7a und dem Mak16/Rpf1–Proteinkomplex. Zusammenfassend konnte durch diese Arbeiten ein bedeutender Fortschritt im Verständnis zur Funktion des Eisen–Schwefel–Clusters des Mak16/Rpf1–Proteinkomplexes in der Ribosomenbiogenese erbracht werden.