Helena Ufelmann

• Microcystine (MCs) und Nodularine (NODs) sind zyklische Hepatotoxine, die wegen ihrer strukturellen Modifikationen eine hohe Diversität aufweisen. Da Cyanobakterien, die diese Toxine produzieren, an vielen Standorten wachsen können, stellt eine Vergiftung durch MCs und NODs weltweit ein ernstes gesundheitliches Problem für Mensch und Tier dar. Die Überwachung von Gewässern erfolgt bislang auf die rechtlich relevanten MCs MC-LR, MC-RR und MC-YR mit Hilfe einer HPLC-UV-Vis-Messmethode gemäß der Norm ISO 20179. Dabei werden aber die ebenfalls vorkommenden MCs, NOD und die entsprechenden Desmethyl-Varianten, über deren Struktur-Wirkungsbeziehung wenig bekannt ist, nicht voneinander getrennt und gemeinsam miterfasst. Durch diese Arbeit sollte die Auswirkung einer Hemmung von Proteinphosphatasen (PP1 und PP2A), über welche MCs und NODs in vivo und in vitro auf Hepatozyten Einfluss nehmen, in primären Ratten- und Humanhepatozyten untersucht werden. Außerdem sollte der Zusammenhang zwischen chemischer Struktur und toxikologischer Relevanz von MCs und NODs und ihrer Desmethyl-Varianten aufgeklärt werden. Sowohl in primären Ratten- als auch in Humanhepatozyten konnte bestätigt werden, dass nicht nur die rechtlich relevanten MCs MC-LR, MC-RR und MC-YR für eine Überwachung von Lebensmitteln und Gewässern entscheidend sind, sondern alle getesteten MCs und NODs und deren desmethylierten Kongenere ein hohes zytotoxisches Potential aufweisen. Dabei kann aber keine direkte Abhängigkeit einer PP-Inhibierung und Zytotoxizität gesetzt werden. Vielmehr spielt die Toxikokinetik wie die Aufnahme der Toxine über spezifische Transporter (OATP) in die Leber und die Entgiftung über den Glutathion-Detoxifizierungsweg eine wichtige Rolle. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die zytotoxische Wirkung auf primäre humane Hepatozyten um ein Vielfaches geringer war als auf primäre Rattenhepatozyten, weshalb von einer Speziesabhängigkeit gesprochen werden kann. Weiterhin wird durch diese Arbeit belegt, dass die MC- und NOD-vermittelte PP-Hemmung zeit- und konzentrationsabhängig sowohl Apoptosen auslöst und als auch in der Lage ist Apoptosemarker wie Bax und Bcl-xL zu beeinflussen und die MAPK-Signalkette aktiviert, was mit Zellproliferation in Verbindung steht. Dabei wies NOD eine stärkere Wirkung auf als MC-LR. Der ebenfalls untersuchte Akt-Signalweg zeigte interessanterweise keine Veränderung in der Kaskade, was auf eine mögliche Gegenregulation zurückgeführt werden kann. Die in vitro Daten weisen darauf hin, dass die Exposition mit hohen Konzentrationen an MCs und NODs in vivo akut starke Leberschäden bis hin zum Tod verursachen. Geringere Konzentrationen dagegen bei einer Langzeitexposition mit kontaminiertem Wasser, Nahrungsergänzungsmitteln und Lebensmitteln MAPK-vermittelt tumorpromovierend und kanzerogen wirken können.
• Contamination of water, foods and food supplements by various genera of cyanobacteria is a serious health problem worldwide for humans and animals, largely due to the toxic effects of microcystins (MCs) and nodularin (NOD), a group of hepatotoxic cyclic peptides. The toxins occur in variable structures resulting in more than 90 different MCs and 8 different NODs, many of them not having been investigated for their toxic potency. Potent MCs such as MC-LR have been shown to elicit their hepatotoxic potency via inhibition of hepatic protein phosphatases (PP) 1 and 2A leading to over-phosphorylation of vital cellular proteins. This mechanism of action is also thought to be responsible for the long term tumor promoting action of certain MCs and NOD in the liver. Here, we report on the isolation of certain MCs and NOD as well as a number of their desmethylated derivatives from algae bloom. Subsequently, we determined the cytotoxicity of these compounds in isolated primary human and rat hepatocytes in culture. In parallel experiments, we analyzed the inhibitory potency of these congeners on PP1 and 2A using commercially available enzymes. We found in primary rat hepatocyts that MC-LR, -YR and NOD were more cytotoxic, namely in the 10 to >50 nM range, while MC-RR was not. The desmethylated congeners of MC-LR, -YR, and NOD were equally or more-toxic as/than their fully methylated counterparts. In primary human hepatocytes we could show that MC-LR, NOD and the desmethylated variants [3Asp]MC-LR, [7Dha]MC-LR and [1Asp]NOD were cytotoxic in the 20 to >600 nM range. Inhibition data with human, bovine and rabbit protein phosphatases 1 and 2A were roughly in accordance with the cytotoxicity findings in human and rat hepatocytes, i.e. desmethylation had no pronounced effects on the inhibitory potencies. Thus, a variety of naturally occurring desmethylated MC and NOD congeners have to be considered as being at least as toxic as the corresponding fully methylated derivatives. Furthermore inhibition of PP1 and PP2A has a time- and concentration-dependent dualistic response on primary rat hepatocytes exposed to MC-LR and NOD, with apoptosis, influence on apoptosis marker Bax and Bcl-xL and activation of MAPK-pathway which leads to cell proliferation. This in vitro data have clearly illustrated the ability of MC-LR and NOD to induce apoptosis, DNA damage and MAPK signaling mediated proliferation in primary rat hepatocytes. Low dose of MCs and NODs cause in a long term exposure an increase of cell proliferation while high doses of toxin reduce cell viability.