Christopher Girke

• Die hier vorgelegte Arbeit konzentrierte sich auf den vakuolären Ribonukleinsäure- (RNA) Abbau in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) und die Integration in den Nukleotid- Metabolismus unter Berücksichtigung von Nukleosidtransportprozessen. Insbesondere die physiologische Bedeutung des Verlustes der RNS2-Aktivität auf die vakuolären RNA-Abbauprozesse sollte untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass RNS2 den größten Anteil an der vakuolären Ribonuklease- (RNase-) Aktivität ausmacht, wobei die Restaktivität von circa 30 Prozent ein Hinweis auf mindestens eine weitere vakuoläre RNase ist. Die vakuolären Adenylatgehalte, Abbauprodukte der RNA, in RNS2-T-DNA-Insertionslinien zeigten, dass RNS2, ähnlich wie die intrazellulären RNasen in L. esculentum, 2‘,3‘-zyklische Nukleotidmonophosphate (2‘,3‘-cNMPs) produzieren. Ferner konnte gezeigt werden, dass in diesen Linien die vakuolären Enzyme sowohl RNA, als auch 2‘,3‘-cNMPs langsamer abbauen als vakuoläre Enzyme aus Wildtyp-Pflanzen. Die Akkumulation dieses zyklischen Intermediates des RNA-Abbaus lässt darauf schließen, dass die Transphosphorylierung schneller verläuft als die Hydrolyse (Abel & Glund, 1987; Löffler et al., 1992; Nürnberger et al., 1990). Es kann angenommen werden, dass ein weiteres Enzym, wie etwa eine zyklische Phosphodiesterase oder eine weitere Ribonuklease, an der Hydrolyse beteiligt ist. Ein weiterer Abschnitt dieser Arbeit beschäftigt sich mit der wichtigen Frage der Qualität von Vakuolenisolationen. Protoplastenkontaminationen konnten mikroskopisch ausgeschlossen werden. Die chloroplastidäre Verunreinigung war mit circa 5 Prozent gering, die cytosolische Kontamination lag jedoch je nach Isolationsmethode bei bis zu 30 Prozent im Vergleich zu Protoplasten. Es konnte darüber hinaus erstmals durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen gezeigt werden, dass Vakuolen RNA besitzen. Diese Oligonukleotide sind vornehmlich kleine Fragmente im Größenbereich bis 50 nt. Next Generation Sequencing ermöglichte eine detaillierte Analyse von cDNA- Bibliotheken, gewonnen aus vakuolärer RNA. Diese Technik wurde unter anderem angewandt, um die Reliabilität des Experimentes zu untersuchen. Es zeigte sich eine große Varianz in der Verteilung der Counts auf die verschiedenen RNA-Loci innerhalb biologischer Replikate und unterschiedlicher Vakuolenisolationsmethoden. Erstmals konnte jedoch gezeigt werden, dass circa 70 Prozent der RNA-Fragmente in der Vakuole von mRNA stammen. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass der Abbau der wenigen rRNA-Transkripte in diesem Organell verstärkt abläuft. In A. thaliana existiert mit ENT7 lediglich ein Vertreter, der einen Export von RNA- Abbauprodukten aus der Zelle ermöglicht. Da er den namensgebenden Vertretern aus dem Reich der Säugetiere strukturell und funktionell ähnelt, ist ENT7 ein geeignetes ENT-Protein für zukünftige Kristallisations- und Strukturanalysen. In dieser Arbeit konnte ENT7-eGFP in Pichia pastoris mit großer Ausbeute (2 mg Protein pro Liter Hefekultur) synthetisiert und in stabiler Form gereinigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ENT7 ohne eGFP ebenfalls stabil und als Dimer vorliegt. Durch Bindungsstudien erfolgte der Nachweis der erfolgreichen Bindung an bekannte Substrate. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass neben Nukleosiden auch Nukleobasen, aber nicht ATP gebunden werden.