Martina Rüger

• NbdA und MucR sind Multi-Domänenproteine aus Pseudomonas aeruginosa. Beide Proteine besitzen eine ähnliche Domänenorganisation mit einer N-terminalen, membranständigen MHYT-Domäne sowie einer GGDEF- und einer EAL-Domäne im Cytoplasma. Die cytosolischen Domänen von MucR sind beide aktiv, während NbdA neben der intakten EAL-Domäne eine degenerierte GGDEF-Domäne mit dem Motiv AGDEF aufweist. Bioinformatischen Vorhersagen zufolge soll die MHYT-Domäne eine sensorische Funktion für diatomische Gase wie Stickstoffmonoxid oder Sauerstoff vermitteln. Die phänotypische Charakterisierung der markerlosen PAO1-Deletionsmutanten \(Delta\)nbdA, \(Delta\)mucR und \(Delta\)nbdA \(Delta\)mucR zeigte, dass NbdA und MucR nicht in die NO-induzierte Dispersion involviert sind. Ebenso konnte in einem neu etablierten heterologen in-vivo-System in E. coli keine NO-sensorische Funktion der Proteine detektiert werden. Im Weiteren wurde festgestellt, dass die MHYT-Domäne keinen ersichtlichen Einfluss auf die Enzymaktivität von NbdA und MucR unter aeroben Bedingungen hat. Demzufolge fungiert die Membrandomäne vermutlich weder als Sensor für Sauerstoff, noch für NO. Anhand heterologer Komplementationstests konnte eine PDE-Aktivität des NbdA-Volllängenproteins nachgewiesen werden. Zudem wurde gezeigt, dass die degenerierte AGDEF-Domäne einen regulatorischen Effekt auf die EAL-Domäne hat, der essentiell für die in- vivo-Aktivität von NbdA ist. In-vivo-Untersuchungen bestätigten die postulierte DGC-Aktivität von MucR. Weiterhin konnte belegt werden, dass MucR ein bifunktionelles Enzym ist. Entgegen den Erwartungen scheint es jedoch im Planktonischen als DGC und im Biofilm als PDE zu fungieren. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung der homologen Überexpression von nbdA in P. aeruginosa, welche teilweise unerwartete Phänotypen ergab. Anhand der homologen Überproduktion einer inaktiven NbdA-Variante stellte sich heraus, dass die Hemmung der Motilität unabhängig von der Aktivität von NbdA auftritt. Massenspektrometrische Analysen deuteten daraufhin, dass NbdA lokal c-di-GMP hydrolysiert. Diese Ergebnisse implizieren, dass NbdA eine Trigger-PDE ist, deren primäre Funktion die Regulation anderer makromolekularer Zielmoleküle ist. In Pseudomonas fluorescens Pf0-1 ist bekannt, dass das NbdA-Homolog Pfl01_1252 mit den Homologen von MucR (Pfl01_2525) und SadC (Pfl01_4451) interagiert. Ergebnisse einer früheren Arbeit lassen eine Interaktion von NbdA und SadC ebenso in P. aeruginosa vermuten. Daher ist denkbar, dass sich NbdA im gleichen Netzwerk wie MucR und SadC befindet und deren Aktivität reguliert.
• NbdA and MucR are multi-domain-proteins from Pseudomonas aeruginosa. They both share a similar domain organisation consisting of a N-terminal memran-anchored MHYTdomain, as well as a GGDEF- and EAL-domain in the cytoplasm. Both cytosolic domains of MucR are active, whereas NbdA possesses besides its active EAL-domain a degenerated GGDEF-domain with an AGDEF-motif. According to bioinformatic predictions the MHYT-domain is proposed to sense diatomic gases such as nitric oxide or oxygen. The phenotypic characterisation of the markerless PAO1 deletion mutants \(Delta\)nbdA, \(Delta\)mucR and \(Delta\)nbdA \(Delta\)mucR revealed that NbdA and MucR are not involved in the NO-induced dispersion. Moreover, no NO-sensory function of the proteins was detected using the newly established heterologous in-vivo-system in E. coli. It turned out that the MHYT-domain has no obvious in uence on the enzymatic activity of NbdA and MucR under aerobic conditions. Hence, the membrane domain probably serves neither as a sensor for oxygen, nor for nitric oxide. The phosphodiesterase activity of full length NbdA was confirmed by heterologous complementation tests. It was also shown that the degenerated AGDEF-domain has a regulatory impact on the EAL-domain which is essential for in vivo activity of NbdA. In vivo studies reassured the postulated diguanylate cyclase activity of MucR. The hypothesis, that MucR was a bifunctional enzyme, was confirmed. Contrary to expectations, MucR acts as a diguanylate cyclase in planktonic mode and as a phosphodiesterase in biofilms. Another aspect of this work was the characterisation of the homologous overexpression of nbdA revealing unexpected phenotypes. Analysis of the homologous overproduction of an inactive NbdA variant revealed that the inhibition of motility is independent of NbdA activity. In addition to that, mass spectrometric data implied only local c-di-GMP hydrolysis by NbdA. These results indicate that NbdA might be a trigger phosphodiesterase whose primary function is the regulation of macromolecular targets. In Pseudomonas fluorescens Pf0-1, it is known that the NbdA homologue Pfl01_1252 interacts with the homologues of MucR (Pfl01_2525) and SadC (Pfl01_4451). Results of a former study also suggested the interaction of NbdA and SadC in P. aeruginosa. Thus, the presence of NbdA in the same network as MucR and SadC, as well as the regulation of their activity by NbdA is possible.