Untersuchungen zur Struktur und Spezifität der Phycobiliproteinlyase CPES aus Guillardia theta

  • Cryptophyten verwenden neben Chlorophyll zusätzliche Lichtsammelproteine für die Photo-synthese – die Phycobiliproteine (PBP). In Cyanobakterien, Rotalgen und Glaukophyten sind PBP ebenfalls ubiquitär verbreitet. Für den Zweck der Lichtsammlung tragen die PBP- Untereinheiten kovalent gebundene offenkettige Tetrapyrrol-Chromophore an konservierten Cysteinresten. Diese Phycobiline sind in der Lage, grünes Licht zu absorbieren und es für die Photosynthese zur Verfügung zu stellen. Die Fähigkeit zur Photosynthese erlangten Crypto-phyten bei der sekundären Endosymbiose durch Aufnahme einer früheren Rotalge. Die evolutionäre Entwicklung brachte schließlich modifizierte PBP hervor. In Gegensatz zu ande-ren Organismen liegen die PBP in Cryptophyten in löslicher Form im Thylakoidlumen des Plastiden vor. Cryptophyten besitzen lediglich einen Typ an PBP, Guillardia theta verwendet Phycoerythrin PE545. Die α-Untereinheiten sind jeweils mit einem Molekül 15,16-Dihydrobi-liverdin (DHBV) und die β-Untereinheiten mit drei Molekülen Phycoerythrobilin (PEB) chromophoryliert. Die Chromophorylierung cryptophytischer Apo-PBP ist bisher wenig un-tersucht und verstanden. Aus Cyanobakterien ist jedoch bekannt, dass die Chromophorylie-rung häufig mit Hilfe von Phycobiliproteinlyasen (PBP Lyasen) stattfindet, welche die Phyco-bilinübertragung unterstützen. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die funktionelle Charakterisierung der eukaryotischen S-Typ-PBP Lyase GtCPES aus G. theta. Mittels Fluoreszenzspektroskopie und Zink-induzierter Fluoreszenz konnte gezeigt werden, dass GtCPES den Transfer von 3(Z)-PEB auf Cys82 der PBP-β-Untereinheit aus Prochlorococcus marinus MED4 (PmCpeB) vermittelt. An der PEB-Bindung sowie am -Transfer beteiligte Aminosäuren wurden mit Hilfe Zielgerichteter Muta-genese identifiziert. Anhand spektroskopischer Binde- und Transferstudien mit den Protein-varianten wurden drei Aminosäuren in der Ligandenbindetasche ermittelt, die relevant für die Bindung sind (Trp69, Glu136, Glu168). Diese koordinieren vermutlich PEB in der Bindetasche und stabilisieren somit die Konformation. Zusätzlich konnten zwei im PEB-Transfer involvierte Aminosäuren eindeutig identifiziert werden (Trp75, Ser150). Trp75 kommt dabei eine essenzielle Bedeutung für den Transfer zu. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Met67 für die auf PEB und DHBV beschränkte Substratspezifität von GtCPES verantwortlich ist. Die Variante GtCPES_M67A bindet sowohl PEB als auch das rigide Phycocyanobilin (PCB) stabil unter Bildung eines farbigen Komplexes in vitro und in vivo in Escherichia coli. GtCPES_M67A scheint zudem in der Lage zu sein, PCB auf geeignete Apo-Proteine zu transfe-rieren. Neben der sterischen und elektrostatischen Umgebung entscheidet damit zusätzlich die Substratspezifität der PBP Lyase über die gebundenen Chromophore am PBP.
  • In addition to chlorophylls cryptophytes employ phycobiliproteins (PBP) for light harvesting during oxygenic photosynthesis. PBPs are also ubiquitously distributed in cyanobacteria, red algae and glaucophytes. For light harvesting, PBP subunits carry covalently attached open-chain tetrapyrrole chromophores called phycobilins. Phycobilins absorb green light and make it available for photosynthesis. Cryptophytes gained the ability for photosynthesis during sec-ondary endosymbiosis by uptake of a former red algae. Eventually, evolutionary development resulted in modified PBPs. In contrast to the majority of organisms in which the individual PBPs are organized in larger aggregates, known as phycobilisomes, cryptophytes employ a single type of PBP which is localized in the thylakoid lumen of the chloroplast. Guillardia theta utilizes the PBP phycoerythrin PE545 which binds one molecule 15,16-dihydrobiliverdin (DHBV) at both α subunits and three molecules of phycoerythrobilin (PEB) at β subunits. Thus far, the attachment of bilins to cryptophycean apo-PBPs is not yet completely understood. However, it is known from cyanobacteria that chromophorylation is often mediated by phy-cobiliprotein lyases (PBP lyases) which support phycobilin transfer. In this thesis, the functional characterization of eukaryotic S-type PBP lyase GtCPES from G. theta was presented. Fluorescence spectroscopy and zinc-induced fluorescence showed that GtCPES mediates transfer and covalent attachment of 3(Z)-PEB to the conserved Cys82 of PBP-β subunit of Prochlorococcus marinus MED4 (PmCpeB). With aid of site-directed muta-genesis amino acid residues involved in phycobilin binding and transfer were identified. By spectroscopic binding and transfer studies with variants, three amino acids in the binding pocket were identified that are relevant for binding PEB (Trp69, Glu136, Glu168). They probably coordinate PEB in the binding pocket and stabilize its conformation. In addition, two amino acid residues involved in PEB transfer were identified (Trp75, Ser150). Here, Trp75 is essential for the transfer. Moreover, one single amino acid residue (Met67) was identified that exchange resulted in 3(E)-phycocyanobilin (PCB) binding variants by reason of larger binding site. Thus, Met67 is responsible for restricted substrate specificity of GtCPES which is usually lim-ited to PEB and DHBV. GtCPES_M67A binds both PEB and PCB in a stable, colorful complex in vitro and in vivo produced in Escherichia coli. Furthermore, GtCPES_M67A seems to be able to mediate PCB transfer to suitable apo-PBP subunits. Therefore, it was shown that PBP lyase substrate specificity in addition to steric and electrostatic protein environment determines PBP attached phycobilins.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Search Google Scholar
Metadaten
Author:Natascha Tomazic
URN:urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-58466
Advisor:Nicole Frankenberg-Dinkel
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Date of Publication (online):2020/01/12
Date of first Publication:2020/01/12
Publishing Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2019/11/21
Date of the Publication (Server):2020/01/21
Tag:Phycobiliproteinlyase
Cryptophyte; GtCPES
GND Keyword:Guillardia theta; Phycobiliproteine; Phycoerythrin
Page Number:171
Faculties / Organisational entities:Kaiserslautern - Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
MSC-Classification (mathematics):92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology
Licence (German):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell (CC BY-NC 4.0)