Loriana Blasius

• Die Sensorkinasen MsmS und RdmS aus dem methanogenen Archaeon M. acetivorans liegen mit Genen, die für die Regulatoren der Msr-Familie, MsrG, MsrF und MsrC, kodieren, assoziiert im Genom vor und sind an der Regulation der methylsulfidspezifischen Methyltransferasen MtsH, MtsD und MtsF beteiligt, die für die Verstoffwechselung von Methylsulfiden innerhalb der Methanogenese von Bedeutung sind. Diese Systeme eignen sich bestens, um die Signaltransduktion in Archaea im Allgemeinen besser zu verstehen und wurden daher im Rahmen dieser Arbeit näher charakterisiert. Im Vorfeld wurden die Sensorkinasen MsmS und RdmS als Häm-basierte Redoxsensoren beschrieben, die an Serin- oder Tyrosinresten phosphoryliert werden. Entgegen dieser Annahme konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass RdmS keine Autokinaseaktivität aufweist und dass die in vorangegangenen Studien identifizierten Phosphorylierungen auf unspezifische Interaktionen der Proteine mit ATP unter den getesteten Bedingungen zurückzuführen sind. ATP-Binde- und Hydrolyseassays konnten allerdings zeigen, dass RdmS in der Lage ist, ATP zu binden und dieses auch zu hydrolysieren. Aufgrund der genomischen Organisation wurde daher ein Phosphatgruppentransfer von RdmS auf den Regulator MsrF untersucht. Dies konnte jedoch nicht bestätigt werden und auch andere Phosphoakzeptor konnten im Zuge dieser Arbeit nicht identifiziert werden. Mit Hilfe von Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie und in vivo Crosslinking-Experimenten konnte die Interaktion der Sensorkinase RdmS mit den Regulatoren MsrF und MsrC und die Interaktion der Sensorkinase MsmS mit dem Regulator MsrG bestätigt werden. Auf Grundlage dieser und vorangegangener Analysen sind die Kinasen jeweils in der Lage, mit allen drei Msr-Regulatoren zu interagieren, weshalb angenommen werden kann, dass das untersuchte Signaltransduktionssystem ein Multi-Komponenten-System darstellt und die Kinasen und Regulatoren miteinander kreuzregulieren. Durchgeführte Electrophoretic mobility shift assays zeigen, dass MsrG, MsrF und MsrC spezifisch an die Promotorbereiche der mts-Gene binden. Dabei konnte eine Bindung jeweils nur an den mts-Promotorbereich identifiziert werden, der mit dem jeweiligen msr-Gene assoziiert auf dem Genom vorliegt. Die Bindestellen von MsrF im mtsD-Promotor und die Bindestelle von MsrG im mtsH-Promotor konnten zudem auf einen ca. 140 bp bzw. 60 bp großen Bereich stromaufwärts des Transkriptionsstarts begrenzt werden und legen beiden Regulatoren somit eine Rolle als Transkriptionsaktivator nahe. Durch Sequenzvergleiche konnte in diesen Bereichen zudem das putative Bindemotiv ATCAA-xxxxxx-TTGAT ausgemacht werden, welches jedoch in weiterführenden Analysen bestätigt werden muss.
• The sensor kinases MsmS and RdmS from the methanogenic archaeon M. acetivorans are associated with genes encoding the regulators of the Msr family, MsrG, MsrF and MsrC, in the genome and are involved in the regulation of the methylsulfide-specific methyltransferases MtsH, MtsD and MtsF, which are important for the metabolism of methyl sulfides within methanogenesis. These systems are best suited to better understand signal transduction in archaea in general and were therefore characterized in more detail in this work. In the past, the sensor kinases MsmS and RdmS were described as heme-based redox sensors that are phosphorylated on serine or tyrosine residues. Contrary to this assumption, it could be shown in this work that RdmS does not have autokinase activity and that the phosphorylations identified in previous studies are due to unspecific interactions of the proteins with ATP under the tested conditions. However, ATP-binding and hydrolysis assays showed that RdmS is able to bind and hydrolyze ATP. Based on the genomic organization, a phosphate group transfer from RdmS to the regulator MsrF was therefore examined. However, this could not be confirmed and other phosphoacceptors could also not be identified in the course of this work. The interaction of the sensor kinase RdmS with the regulators MsrF and MsrC and the interaction of the sensor kinase MsmS with the regulator MsrG were confirmed by surface plasmon resonance spectroscopy and in vivo crosslinking experiments. Based on these and previous analyses, the kinases are each able to interact with all three Msr-regulators, suggesting that the studied signal transduction system is a multi-component system and that the kinases and regulators cross-regulate with each other. Electrophoretic mobility shift assays have shown that MsrG, MsrF and MsrC specifically bind to the promoter regions of the mts-genes. In each case, binding could only be identified in the mts-promoter region associated with the respective msr-gene in the genome. In addition, the binding sites of MsrF in the mtsD-promoter and the binding site of MsrG in the mtsH-promoter could be limited to an approximately 140 bp and 60 bp large region upstream of the transcription start, respectively, suggesting that both regulators act as transcription activators. In addition, the putative binding motif ATCAA-xxxxxx-TTGAT could be identified in these areas by sequence comparisons, which however must be confirmed in further analyses.