Eileen Anna Agnes Bischoff

• Zur nukleophilen Detektion von Sulfensäuren werden üblicherweise Dimedon oder Dimedon Derivate eingesetzt. Allerdings haben qualitative Untersuchungen gezeigt, dass Dimedon ebenso mit cyclischen Sulfenamiden reagiert. Unter physiologischen Bedingungen muss Dimedon zudem mit millimolaren Glutathionkonzentrationen konkurrieren, welches ebenfalls ein starkes Nukleophil ist. Um diese kompetitiven Reaktionen quantitativ zu analysieren, wurden die Reaktionskinetiken eines cyclischen Sulfenamid-Modellpeptids (SA) und der Sulfensäure von Glutathion mit Dimedon und Glutathion bestimmt. Da das cyclische Sulfenamid bei niedrigen pH-Werten stabilisiert war und keine Ringöffnung zur Sulfensäure stattgefunden hat, konnte eine direkte Reaktion mit Dimedon eindeutig nachgewiesen werden. Die kinetischen Analysen ergaben vergleichbare Geschwindigkeitskonstanten für die Reaktionen von Dimedon mit SA bzw. Dimedon und der aus SA gebildeten Sulfensäure. Die Geschwindigkeiten der Reaktionen des Konkurrenz-Nukleophils Glutathion mit SA oder der Sulfensäure übertrafen die Reaktionsgeschwindigkeiten mit Dimedon jedoch um mehrere Größenordnungen. Der bisher scheinbar erfolgreiche Einsatz von Dimedon als Detektionsprobe für Sulfensäuren in vivo muss daher auf alternative Reaktionswege oder auf die Detektion kinetisch konkurrierender Redoxspezies zurückzuführen sein. (Anmerkung: übersetzt aus Bischoff E, Lang L, Zimmermann J, Luczak M, Kiefer AM, Niedner-Schatteburg G, Manolikakes G, Morgan B, Deponte M. Glutathione kinetically outcompetes reactions between dimedone and a cyclic sulfenamide or physiological sulfenic acids. Free Radic Biol Med. 2023 Nov 1; 208:165-177. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2023.08.005. Epub 2023 Aug 3. PMID: 37541455.) Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der oxidativen Stress-Hypothese im Malaria-Parasiten Plasmodium falciparum. Die Gesamtheit aus Hämoglobinabbau, Wachstum und DNA-Synthese verursachen eine metabolisch generierte oxidative Belastung. Durch effiziente Reduktionsmittel wie z. B. Thioredoxine oder Glutathion kann der Parasit das Redox-Gleichgewicht aufrechterhalten, er hat eine physiologische STRESSistance. Es wird außerdem vermutet, dass Superoxidanionen und Wasserstoffperoxid eine bedeutende Rolle im Wirkmechanismus von Antimalariamitteln spielen. In dieser Arbeit sollten kompartimentspezifische Anpassungseffekte oder cytotoxische Effekte, verursacht durch Wasserstoffperoxid untersucht werden. Hierfür wurden transgene Parasiten verwendet, die das heterologe Redoxenzym RgDAAO im Cytosol, der Verdauungsvakuole oder der mitochondrialen Matrix bzw. dem mitochondrialen Intermembranraum enthalten. Durch exogene Zugabe von D-Aminosäuren konnten die Wasserstoffperoxidkonzentrationen kompartimentspezifisch erhöht werden. Zudem war die gebildete Enzymmenge an RgDAAO in Abhängigkeit der Konzentration des Selektionsantibiotikums Blasticidin regulierbar. Zu jedem Konstrukt wurde als Negativkontrolle ein identisches Plasmid mit der Punktmutation R285A generiert und transfiziert, was zur Bildung einer inaktiven Form der RgDAAO im Parasiten führte. Im ersten Schritt konnte die erfolgreiche Bildung der RgDAAO für die verschiedenen 3xHA-getaggten Konstrukte mittels Westernblotanalyse gezeigt werden. Auch die Titrierbarkeit des Systems durch Blasticidin konnte mittels Westernblotanalyse nachgewiesen werden, für den die Parasiten mit unterschiedlichen Blasticidin-Konzentrationen zwischen 4 und 50 µg/ml behandelt wurden. Ab 50 µg/ml Blasticidin kam es zu cytotoxischen Effekten. Die Lokalisation des heterologen Redoxenzyms RgDAAO in den vorgesehenen Kompartimenten wurde mittels Immunofluoreszenzmikroskopie überprüft. Die korrekte Lokalisation wurde für die Kompartimente Cytosol und die mitochondriale Matrix beobachtet, wohingegen trotz erhöhtem Selektionsdruck von 15 µg/ml Blasticidin, keine RgDAAO in der Verdauungsvakuole und dem mitochondrialen Intermembranraum nachgewiesen werden konnte. Schließlich wurden erste IC50-Messungen mit Paraquat als Positivkontrolle und verschiedenen D-Aminosäuren zur kompartimentspezifischen Erhöhung der Wasserstoffperoxidkonzentrationen durch das Redoxenzym RgDAAO durchgeführt. Es konnten kompartimentspezifische Anpassungseffekte und potenzielle cytotoxische Effekte beobachtet werden.