Sabrina Kaiser

• Cellular elongation contributes to fast and efficient plant growth. In root cells of Arabidopsis thaliana, elongation is inhibited by the plant hormone auxin. Auxin-induced restrictions in cell size are accompanied by morphological alterations of the plants largest organelle, the vacuole. Changes of vacuolar morphology and decrease of vacuolar size upon auxin application have been shown to be dependent on the actin cytoskeleton. However, the connection between actin filaments and the vacuole remained elusive. In this thesis, putative candidates for actin-tonoplast linkage, the NET4 family members NET4A and NET4B from the plant-specific actin-binding and membrane-associated Networked (NET) superfamily, were functionally characterized by combining genetic, biochemical and cell biological approaches. Examination of knockout and overexpression lines by confocal laser-scanning microscopy revealed that NET4 proteins are able to alter vacuolar morphology as well as actin organization. Using 3D surface rendering of cells and vacuoles, elevated NET4 levels were demonstrated to result in more compact and smaller vacuoles. Similar to auxin-induced smaller vacuoles, this reduction of vacuole size was accompanied by restricted cellular and organ growth. However, NET4-mediated morphological changes of the vacuole were found not to be directly facilitated by auxin, suggesting that NET4 proteins act in another mechanism for regulating vacuole morphology. Thus, limiting vacuole size was further hypothesized to be a general method to restrict cell expansion. Experiments to investigate the impact of NET4 upon impairments of the actin cytoskeleton or the vacuole fusion machinery indicated that NET4 participates in homotypic vacuole fusion. This was further substantiated by interaction and gene deletion studies. Surprisingly, both NET4 proteins but also NET3A and NET3C were found to interact with tonoplast-residing RAB GTPases (RABG3s), thereby recruiting actin filaments to vacuolar fusion sites. Moreover, an additional interaction was demonstrated for NET4 and the ER-resident contact site protein VAP27-1, which is known to interact with NET3C for establishing ER-PM contact sites. When analyzing CRISPR-based net3c net4a net4b triple mutants, misshaped and sometimes partially fragmented and smaller vacuoles could be observed, which was correlated with restricted root growth. This supports a role of NET3/NET4 in homotypic vacuole fusion and demonstrates the importance of vacuole integrity for plant growth. Based on these results, it could be concluded that NET4 and NET3 proteins redundantly function to recruit actin filaments to tonoplast-localized RABG3s, altering vacuolar morphology and size by enabling homotypic vacuole fusion. In addition, NET3s and NET4s were hypothesized to redundantly interact with VAP27-1, RABG3 and actin filaments to establish a yet unknown plant membrane contact sites between the vacuole and the ER.
• Die zelluläre Streckung ist wichtig für ein schnelles und effizientes Pflanzenwachstum. In Wurzelzellen von Arabidopsis thaliana wird dieser Streckungsprozess durch das Phytohormon Auxin inhibiert. Auxin-induzierte Limitierungen der Zellgröße werden von morphologischen Veränderungen des größten Pflanzenorganells, der Vakuole, begleitet. Es ist gezeigt worden, dass diese Änderungen der Vakuolenmorphologie sowie die damit einhergehende Vakuolenverkleinerung vom Aktin-Zytoskelett abhängen. Die Verbindung zwischen Aktinfilamenten und der Vakuole verblieb bislang jedoch weitgehend unklar. In dieser Arbeit wurden mittels genetischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden die NET4 Familienmitglieder NET4A und NET4B von der pflanzenspezifischen Aktin-bindenden und Membran-assoziierten „Networked“ (NET)-Überfamilie als vermeintliche Kandidaten für eine Aktin-Tonoplast Verbindung funktionell charakterisiert. Mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchte Knockout- und Überexpressions-Linien zeigten, dass NET4-Proteine in der Lage sind die Vakuolenmorphologie sowie die Organisation von Aktinfilamenten zu verändern. Durch 3D-Oberflächenmodellierung von Zellen und Vakuolen konnte nachgewiesen werden, dass erhöhte Mengen an NET4 zu kompakteren und kleineren Vakuolen führen. Diese Verringerung der Vakuolengröße war, ebenso wie bei der Auxin-induzierten Vakuolenverkleinerung, von einem reduzierten Zell- und Organwachstum begleitet. Eine direkte Vermittlung der NET4-bedingten Veränderungen der Vakuolenmorphologie über Auxin konnte jedoch ausgeschlossen werden, was darauf hindeutet, dass NET4-Proteine die Vakuolenmorphologie über einen anderen Mechanismus beeinflussen. Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Limitierung der Vakuolengröße eine generelle Methode zur Inhibierung der Zellexpansion darstellt. Untersuchungen zum NET4-Einfuss bei Beschädigung des Aktin-Zytoskeletts oder der vakuolären Fusionsmachinerie legten nahe, dass NET4 an der homotypischen Vakuolenfusion beteiligt ist. Dies konnte durch zusätzliche Interaktions- und Gendeletionsstudien untermauert werden. Für beide NET4-Proteine, aber auch für NET3A und NET3C, konnten überraschenderweise Interaktionen mit Tonoplast-ansässigen RAB GTPases (RABG3s) nachgewiesen werden, wodurch sie Aktinfilamente an vakuoläre Fusionsstellen rekrutieren können. Weiterhin wurden zusätzliche Interaktionen zwischen NET4 und dem im ER ansässigen Membrankontaktstellenprotein VAP27-1 gezeigt, welches für eine Interaktion mit NET3C zum Aufbau von ER-PM Kontaktstellen bekannt ist. Bei der Analyse von CRISPR-generierten net3c net4a net4b Dreifachmutanten konnten deformierte und manchmal teilweise fragmentierte sowie kleinere Vakuolen beobachtet werden, was mit einem eingeschränkten Wurzelwachstum korrelierte. Dies untermauert eine Rolle von NET3/NET4 bei der homotypischen Vakuolenfusion und demonstriert die Relevanz der vakuolären Integrität für das Pflanzenwachstum. Aus diesen Ergebnissen konnte geschlussfolgert werden, dass NET4 und NET3 Proteine in redundanter Weise Aktin-Filamente an Tonoplast-lokalisierte RABG3s rekrutieren und damit die Morphologie sowie Größe der Vakuole durch Regulierung der homotypischen Vakuolenfusion verändern. Zudem wurde die Hypothese aufgestellt, dass NET3s und NET4s gleichermaßen mit VAP27-1, RABG3 sowie Aktin-Filamenten interagieren, um bislang unbekannte Membrankontaktstellen zwischen der Vakuole und dem ER zu etablieren.