Lukas Philipp Hewener

• Verbindungen aus Eisen- und säurelabilen Schwefel-Ionen, Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster, dienen als einer der wichtigsten und ältesten Proteinkofaktoren. Das Proteom der Hefe umfasst, wie auch bei den meisten Eukaryoten, zwei Synthesewege dieser Fe/S Cluster. Zum einen das Iron-Sulfur-Cluster-System (ISC), welches für die Synthese von Fe/S-Kofaktoren und deren Integration in die kofaktorabhängigen Proteine der Mitochondrien zuständig ist. Zusätzlich wird für die Synthese und Integration der zytosolischen Fe/S-Kofaktoren die Cytosolic-Iron-Sulfur-Assembly-Maschinerie (CIA) benötigt. Damit ist sie essentiell für lebenswichtige Prozesse wie die DNA-Replikation, -Reparatur, -Transkription und Proteinbiosynthese. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch genetische Manipulation der chromosomalen DNA von Saccharomyces cerevisiae eine Bibliothek an verschiedenen CIA-(Doppel-)Mutanten generiert. Da die CIA-Gene essentiell sind, wäre eine Deletion letal. Deshalb wurden die natürlichen Promotoren durch galaktoseregulierbare Promotoren ersetzt. Die introduzierten Promotoren erlaubten eine gezielte und nahezu vollständige Depletion der jeweiligen Proteine durch Wachstum für eine geeignete Zeit in galaktosefreiem Medium. Nach einer gründlichen Charakterisierung der Stämme über PCR, DNA-Sequenzierung, Western Blots, Isopropylmalat-Isomerase Aktivitätsmessungen und der phänotypischen Analyse des Wachstums wurden diese Mutanten genutzt, um über quantitative, massenspektrometrische Proteom-Analyse die Auswirkungen einer Beeinträchtigung der CIA-Maschinerie, wie sie zum Beispiel bei Eisen-Mangel oder in einigen Krankheiten vorkommen, zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass nicht alle CIA-Mutationen den gleichen Phänotyp aufzeigen, ein Hinweis darauf, dass manche CIA-Proteine eine kritischere Funktion im Fe/S-Biosyntheseweg ausüben. Unter anderem konnte die Rolle einzelner CIA-Proteine in der Regulation des Eisenhaushaltes näher beleuchtet werden. Studien mit humanen Systemen wurden unter der Annahme einer deutlichen Instabilität von Apo-Protein gegenüber der Holo-Form, was sich auf die Abundanz auswirkt, durchgeführt (Stehling et al., 2008; Stehling et al., 2013). Diese Arbeit zeigt, dass auch in Hefe manche Fe/S-Proteine deutliche Abundanzunterschiede bei Kofaktormangel zeigen. Nicht alle Fe/S-Proteine reagierten gleich auf die Depletion, eine Priorisierung der Klientenproteine kann als wahrscheinlich angesehen werden. Auch konnten, ergänzend zu früheren Studien (Paul, 2014), weitere Fe/S-Proteine als Klienten der CIA-Adaptorproteine Yae1 und Lto1 ausgeschlossen werden. Neben den Auswirkungen auf die zytosolischen Fe/S-Proteine konnten auch die Auswirkungen der CIA-Depletion auf die wichtigsten Stoffwechselprozesse analysiert werden. Viele Biosynthesewege zeigen eine gegenseitige Beeinflussung und Regulation durch die beteiligten Proteine und Intermediate. Auch die CIA-Maschinerie ist einer intrikaten, multifaktoriellen Regulation unterlegen. Im Verlauf dieser Arbeit konnten Grx4 und Nar1 als Hauptakteure der Regulation innerhalb der CIA-Maschinerie identifiziert werden. Zudem konnten Hinweise auf die zytosolische Lokalisierung der Fe/S-haltigen Glutamat-Synthase Glt1 erlangt werden. Während frühere Studien die Lokalisierung dieses Proteins in den Mitochondrien suggerierten, konnte hier eine eindeutige Abhängigkeit von der CIA-Maschinerie gezeigt werden, was eine zytosolische Lokalisierung impliziert. Dies eröffnet die Möglichkeit, Messungen der Glt1-Aktvität als neues Assay zur Untersuchung der CIA-Aktvität zu nutzen.
• Compounds made of iron and acid-labile sulfur, iron-sulfur (Fe/S) clusters, serve as one of the most important and oldest protein cofactors. The yeast proteome, as well as most eukaryotes, comprises of two synthesis pathways for those Fe/S clusters. One is the Iron-Sulfur Cluster system (ISC), which is responsible for the synthesis of iron sulfur cofactors and their integration into the cofactor-dependent mitochondrial proteins. Additionally the Cytosolic Iron-Sulfur-Assembly machinery (CIA) is responsible for the synthesis and integration of cytosolic iron-sulfur cofactors. It is therefore essential for vital processes such as DNA-replication, -repair, -transcription and protein biosynthesis. Within the scope of this work, genetic manipulation of the chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae was used to create a library of different CIA (double-) mutants. Since the deletion of the mostly essential CIA genes would be lethal, their natural promoters were replaced by galactose-regulatable promoters. The introduced regulatable promoters enabled a targeted and almost complete depletion of the respective proteins by growth in galactose-free medium. After thorough characterization of the strains via PCR, DNA sequencing, Western blot, isopropylmalate isomerase activity measurements and phenotypic analysis of growth, these mutants were used to study the effects of impairment of the CIA machinery, such as those found in iron deficiency or in some diseases, via quantitative mass spectrometric proteomic analysis. It was shown that not all CIA mutations exhibit the same phenotype, indicating that some CIA proteins have a more critical function in the Fe/S biosynthetic pathway. Among other things, the role of individual CIA proteins in the regulation of iron homeostasis could be examined in more detail. Studies with human systems were performed under the assumption of a clear instability of apo-protein compared to the holo-form, which affects abundance (Stehling et al., 2008; Stehling et al., 2013). This work shows that, in yeast, some Fe/S proteins show significant abundance differences when deficient in cofactors. Not all Fe/S proteins responded equally to depletion; a prioritization of client proteins can be considered likely. The specificity of the CIA proteins Yae1 and Lto1 as adaptor proteins could also be defined more precisely, excluding more Fe/S-proteins from being dependent on Yae1 and Lto1 than in previous studies (Paul, 2014). In addition to the effects on the cytosolic Fe/S proteins, the effect of CIA depletion on the most important metabolic processes has been analyzed aswell. Many biosynthetic pathways show a mutual influence and regulation by the proteins and intermediates involved. The CIA machinery is also subject to intricate, multifactorial regulation. In the course of this work, Grx4 and Nar1 were identified as the main regulatory players within the CIA machinery. In addition, evidence for the cytosolic localization of the Fe/S-containing glutamate synthase Glt1 was obtained. While previous studies suggested a mitochondrial localization of this protein, a clear dependence on the CIA machinery could be shown here, which implies a cytosolic localization. This opens up the possibility of using Glt1 activity measurements as a new assay to study CIA activity.