Matthias Stefan Emanuel

• Benzene is a natural constituent of crude oil and a product of incomplete combustion of petrol and has been classified as “carcinogenic to humans” by IARC in 1982 (IARC 1982). (E,E)- Muconaldehyde has been postulated to be a microsomal metabolite of benzene in vitro (Latriano et al. 1986). (E,E)-Muconaldehyde is hematotoxic in vivo and its role in the hematotoxicity of benzene is unclear (Witz et al. 1985). We intended to ascertain the presence of (E,E)-muconaldehyde in vivo by detection of a protein conjugate deriving from (E,E)-muconaldehyde. Therefore we improved the current synthetic access to (E,E)-muconaldehyde. (E,E)- muconaldehyde was synthesized in three steps starting from with (E,E)-muconic acid in an overall yield of 60 %. Reaction of (E,E)-muconaldehyde with bovine serum albumin resulted in formation of a conjugate which was converted upon addition of NaBH4 to a new species whose HPLC- retention time, UV spectra, Q1 mass and MS2 spectra matched those of the crude reaction product from one pot conversion of Ac-Lys-OMe with (E,E)-muconaldehyde in the presence of NaBH4 and subsequent cleavage of protection groups. Synthetic access to the presumed structure (S)-2-ammonio-6-(((E,E)-6-oxohexa-2,4-dien-1- yl)amino)hexanoate (Lys(MUC-CHO)) was provided in eleven steps starting from (E,E)- muconic acid and Lys(Z)-OtBu*HCl in 2 % overall yield. Additionally synthetic access to (S)-2-ammonio-6-(((E,E)-6-hydroxyhexa-2,4-dien-1-yl)amino)hexanoate (Lys(MUC-OH)) and (S)-2-ammonio-6-((6-hydroxyhexyl)amino)hexanoate (IS) was provided. With synthetic reference material at hand, the presumed structure Lys(MUC-OH) could be identified from incubations of (E,E)-muconaldehyde with bovine serum albumin via HPLC-ESI+- MS/MS. Cytotoxicity analysis of (E,E)-muconaldehyde and Lys(MUC-CHO) in human promyelocytic NB4 cells resulted in EC50 ≈ 1 μM for (E,E)-muconaldehyde. Lys(MUC-CHO) did not show any additional cytotoxicity up to 10 μM. B6C3F1 mice were exposed to 0, 400 and 800 mg/kg b.w. benzene to examine the formation of Lys(MUC-OH) in vivo. After 24 h mice were sacrificed and serum albumin was isolated. Analysis for Lys(MUC-OH) has not been performed in this work.
• Benzol ist ein natürlicher Bestandteil von Rohöl und entsteht bei unvollständiger Verbrennung von fossilen Treibstoffen. Benzol wurde von der IARC 1982 als kanzerogen für den Menschen eingestuft (IARC 1982). (E,E)-Muconaldehyd ist als mikrosomaler Metabolit von Benzol in vitro postuliert worden (Latriano et al. 1986). (E,E)-Muconaldehyd ist hämatotoxisch in vivo and seine Rolle für die Hämatotoxizität von Benzol ist nicht geklärt (Witz et al. 1985). Wir beabsichtigten die Präsenz von (E,E)-Muconaldehyd in vivo durch Detektion eines (E,E)- Muconaldehyd abgeleiteten Proteinkonjugates zu verifizieren. Im Zuge dieser Arbeit wurde der synthetische Zugang zu (E,E)-Muconaldehyd verbessert. (E,E)-Muconaldehyd wurde in drei Schritten ausgehend von (E,E)-Muconsäure in einer Gesamtausbeute von 60 % synthetisiert. Reaktion von (E,E)-Muconaldehyd mit Rinderserumalbumin resultierte in der Bildung eines Konjugates, welches nach Umsetzung mit Natriumborhydrid hinsichtlich HPLC-Retentionszeit, UV-Spektrum, Q1 Masse und MS2 Spektrum mit dem übereinstimmte, welches eine Reaktionsmischung aus Ac-Lys-OMe mit (E,E)-Muconaldehyd in Gegenwart von Natriumborhydrid und anschließender Abspaltung der Schutzgruppen ergab. Synthetischer Zugang zu der vermuteten Struktur (S)-2-Ammonio-6-(((E,E)-6-oxohexa-2,4- dien-1-yl)amino)hexanoat (Lys(MUC-CHO)) gelang in elf Schritten ausgehend von (E,E)- Muconsäure und Lys(Z)-OtBu*HCl in 2 % Gesamtausbeute. Zusätzlich gelang die Synthese von (S)-2-Ammonio-6-(((E,E)-6-hydroxyhexa-2,4-dien-1-yl)amino)hexanoat (Lys(MUCOH)) sowie (S)-2-Ammonio-6-((6-hydroxyhexyl)amino)hexanoat (IS). Mit Zugang zu Referenzmaterial wurde die vermutete Struktur Lys(MUC-OH) in Inkubationen von (E,E)-Muconaldehyde mit Rinderserumalbumin nachgewiesen. Die Cytotoxizität von (E,E)-Muconaldehyd und Lys(MUC-CHO) in humanen promyelozytischen NB4 Zellen resultierte in EC50 ≈ 1 μM für (E,E)-Muconaldehyd. Lys(MUC-CHO) zeigte keine relevante Cytotoxizität im Konzentrationsbereich bis 10 μM. B6C3F1 Mäusen wurde 0, 400 und 800 mg/kg KG Benzol peroral verabreicht um die Bildung von Lys(MUC-OH) in vivo zu untersuchen. Nach 24 h wurden die Tiere getötet und Serumalbumin isoliert. Lys(MUC-OH) wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr analysiert.